Visualisierung Bodenmikroorganismen per Kontaktformular schieben Assay und Mikroskopie

Environmental Microbiology

Your institution must subscribe to JoVE's Environmental Sciences collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Overview

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Bradley Schmitz

Boden umfasst die dünne Schicht an der Erdoberfläche, mit biotischen und abiotischen Faktoren, die dazu, Leben beitragen. Der abiotische Anteil umfasst anorganischer Partikeln bis hin in Form und Größe, die Beschaffenheit des Bodens zu bestimmen. Die biotische Teil beinhaltet Pflanzenreste, Wurzeln, organischen Stoffen und Mikroorganismen. Boden Mikrobe Fülle und Vielfalt ist weiträumig, da ein Gramm Boden 107-8 Bakterien, 106-8 Aktinomyceten 105-6 Pilze, 103 Hefe, 104-6 Protozoen, 103-4 Algen und 53 Nematoden enthält. Zusammen bilden die biotischen und abiotischen Faktoren Architekturen um Pflanzenwurzeln, bekannt als der Rhizosphäre, die günstige Bedingungen für Bodenmikroorganismen zu bieten.

Biotische und abiotische Faktoren fördern, Leben im Boden. Allerdings tragen sie auch stressig Dynamik, die Mikroben zu begrenzen. Biotischen Stress beinhaltet Wettbewerb zwischen den Leben anzupassen und Umweltbedingungen zu überleben. Zum Beispiel können Mikroben hemmende oder toxische Substanzen zu benachbarten Mikroorganismen Schaden absondern. Penicillium Notatum ist ein berühmt-berüchtigten Pilz, da es Konkurrenz um Nährstoffe reduziert durch die Herstellung einer antimikrobielles, welche Menschen zu ernten, um die pharmazeutischen Penicillin zu erstellen. Abiotische Belastungen ergeben sich aus physikalischen oder chemischen Eigenschaften, die Begrenzung der mikrobiellen überleben, wie Licht, Feuchtigkeit, Temperatur, pH-Wert, Nährstoffe und Textur.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Umwelt-Mikrobiologie. Visualisierung Bodenmikroorganismen per Kontaktformular schieben Assay und Mikroskopie. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

Direkt beobachten die Zusammenhänge zwischen Bodenorganismen, Partikel und Verhaltensweisen innerhalb unterschiedlicher Boden Umgebungen ist schwierig, aber der Kontakt Folie Test, auch bekannt als die begraben-Slide-Technik, entwickelt von Rossi Et al. (1936) bietet einen Momentaufnahme Aussichtspunkt in Bodenmikrobiologie. Diese Methode eignet sich für die Beobachtung Bodenpilze, Actinomyceten und Bakterien über Mikroskopie. Obwohl es nicht für mikrobielle Quantifizierungen vorgesehen ist, impliziert als es nur ein kleinen Teil einer größeren heterogenen Umgebung.

Diese Methode wird leicht durch vergraben einen Objektträger in Boden für mehrere Tage, dann befestigen die Mikroorganismen auf der Folie mit Essigsäure durchgeführt. Die Mikroben sind mit Rose Bengal Farbstoff gefärbt und über Mikroskopie mit Ölimmersion auf dem 100 X Objektiv beobachtet. Drei mikrobielle Gruppen lassen sich unterscheiden, wie Bakterien als kleine abgerundete Formen, Actinomyceten Filamente als dünne Saiten und pilzliche Hyphen als dicke Fäden erscheinen. Im Boden, fast alle Bakterien sind kleiner und runder als diejenigen in Reinkultur durch Ernährung Stress, wodurch schrumpfen und Rundung für eine günstigere Oberfläche: Volumen-Verhältnis. Die unregelmäßigen dunklen Formen nicht befleckt sind Bodenteilchen. Verschiedenen Nährstoffen Änderungsanträge können hinzugefügt werden, auf den Boden, Kohlenstoff und Glukose Quellen bereitzustellen, die Wachstum von Mikroorganismen und Interaktionen zu fördern. Diese Technik ermöglicht eine einfache Beobachtung der Bodenmikrobiologie und hilft, um mehrere Organismen in der Umwelt zu identifizieren.

Procedure

1. Folie Mikrokosmos Bodenbearbeitung

  1. Gartenerde zu sammeln, von der Oberfläche (0-6 "Tiefe), und wiegen 150 g Boden in zwei separaten Tassen.
    1. Wenn Boden hohen Dichte an organischer Substanz hat, wiegt 100 g.
  2. Beschriften Sie eine Tasse "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
  3. Berechnen Sie die Menge an Wasser benötigt, um Feuchtigkeit-Inhalt zu verändern.
    1. Feuchtigkeit-Inhalt ist oft in der Nähe von Feldkapazität.
      Equation 1 1
  4. Maßnahme Menge von destilliertem Wasser mit einem Messzylinder.
  5. Zwei Fläschchen Gießen Sie Menge von destilliertem Wasser.
  6. Label ein Fläschchen "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
  7. Ändern Sie das Wasser in der "Behandlung" Durchstechflasche mit genügend Glukose für eine endgültige Boden Glukosekonzentration von 1 %, nach einer trockenen Gewicht-Basis im Boden "Behandlung".
  8. 200 mg NH4Nr.3 in der "Behandlung" Fläschchen und rühren um die Änderungen zu lösen. Das Nitrat dient als Stickstoffquelle von Nährstoffen für die Bodenmikroben.
  9. Ändern Sie das "Control"-Fläschchen nicht.
  10. In kleinen Aliquote von etwa 50 mg Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Behandlung" in die "Behandlung"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
  11. In kleinen Aliquote Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Control" in der "Control"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
  12. Vier saubere Objektträger beschriften: zwei "Behandlung" und zwei "Steuern" Folien.
  13. Stecken Sie die beiden Folien "Behandlung" in der "Behandlung" Boden-Cup, und stecken Sie die beiden "Control"-Folien in der "Control" Boden-Cup. Lassen Sie 2 cm auf jeder Folie über der Bodenoberfläche zu projizieren, und achten Sie darauf, eine Lücke zwischen den beiden Folien zu verlassen.
  14. Die Tassen mit Plastikfolie abdecken und mit einem Gummiband befestigen.
  15. Punktion der Wrap mehrmals, damit die Luft, aber nach wie vor übermäßiger Verdunstung zu verhindern.
  16. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
  17. 7 Tage inkubieren Sie die Erde gefüllten Tassen bei Raumtemperatur in einem dafür vorgesehenen Bereich/Inkubator.

2. Folie Färbung und Mikroskopie

  1. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
  2. Berechnen Sie die Bodenfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Folie entfernen.
  3. Entfernen Sie die beiden Folien aus jede Tasse indem Sie auf jeder Folie in eine Schräglage und zurückziehen, so dass die obere Fläche der Folie nicht gestört wird.
  4. Identifizieren Sie und markieren Sie die Seite des Schlittens gebeizt und beobachtet werden.
  5. Klopfen Sie leicht die Folien auf der Bank-Oberseite, große Schmutzpartikel zu entfernen.
  6. Mit einem feuchten Papiertuch reinigen Sie die untere Fläche der Folien. Trocknen Sie die Folien bei Zimmertemperatur.
  7. Schutzbrille trägt und hält jede Folie mit der Pinzette, tauchen die Folien in 40 % (V/V) Essigsäure für 1-3 min unter einem Abzug.
  8. Waschen Sie die überschüssige Säure unter einem sanften Strahl des Wassers.
  9. Bedecken Sie mit Hilfe einer Tropfflasche, die Oberfläche der Folien mit phenolischen Rose Bengal. Unterstützen Sie die Folie auf einem Färbung Gestell über einen Behälter, den überschüssige Fleck zu fangen. Seien Sie vorsichtig, nicht mit Kraft, die Mikroorganismen von der Oberfläche der Folien entfernen kann waschen.
  10. Fleck, die Folien für 5-10 min. nicht lassen Sie die Folie werden, trocken. Mehr Fleck nach Bedarf hinzufügen.
  11. Waschen Sie vorsichtig die Folien um überschüssige Fleck zu entfernen.
  12. Lassen Sie die Folien bei Zimmertemperatur trocknen.
  13. Mit der Öl-Immersion-Ziel, beobachten Sie die Folie mit einem Mikroskop (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1. Eine Folie unter dem Mikroskop.

Die Beziehungen zwischen den verschiedenen Organismen und anorganischen Komponenten im Boden sind wichtig zum Verständnis Bodenveränderungen und Umweltbelastungen, aber können nicht ohne direkte Visualisierung aufgeklärt werden.

Boden, ein äußerst komplexes System ist ein Lebensraum für Millionen von verschiedenen Organismen. Die Region der Erde direkt um Pflanzenwurzeln insbesondere die Rhizosphäre genannt, enthält eine einzigartige Palette von Organismen, die durch die Wurzeln der Pflanzen direkt beeinflusst werden.

Die abiotische oder nicht-biologischen, Bestandteil der Rhizosphäre umfasst anorganische Partikeln bis hin in Größe und Form, die die Bodentextur beitragen. Der biotische oder biologischen, Anteil umfasst Pflanzenreste, Wurzeln, organischen Stoffen und Mikroorganismen.

Dieses Video veranschaulicht die direkte Visualisierung der biotischen und abiotischen Komponenten der Rhizosphäre Boden, um Faktoren, die die Bodenveränderungen zu verstehen und vorherzusagen Umweltbelastungen.

Mikroskopisch kleine Organismen sind in der Regel im Umkreis von Bodenporen Wasser befinden. Bakterien gehören zu den einfachsten und reichlichste Organismen im Boden zu präsentieren und finden sich in vielen Morphologien einschließlich Sphären genannt Kokken, Stäbchen genannt Bazillen und filamentösen Formen.

Pilzarten, wie Hefen und Schimmelpilzen, sind die zweithäufigste Organismen im Boden. Gemeinsam zerlegen und recyceln toter organischen Materie. Mikroskopischen filamentöse Pilze visuell unterscheiden sich von anderen Mikroorganismen, wie sie lange und verzweigte Hyphen besitzen, die Sporen freisetzen.

Direkter Beobachtung der Beziehungen zwischen diesen Organismen ist eine Herausforderung, aber mit einem Kontakt Folie Assay erreicht werden kann. Diese Methode wird durchgeführt, indem Sie eintauchen einen Objektträger in Boden für mehrere Tage und die Organismen und Bodenteilchen zu adsorbieren an die Oberfläche der Folie.

Die Folie wird dann schräg gegen Verschmieren der Oberfläche entfernt. Die Mikroben sind mit Essigsäure fixiert und gefärbt mit Rose Bengal Fleck, Visualisierung über Lichtmikroskopie zu ermöglichen.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter den Kontakt Folie-Assay-Technik zu verstehen, werfen wir einen Blick auf den Prozess im Labor.

Zunächst sammeln Sie Oberfläche Gartenerde und übertragen Sie den Boden ins Labor zu. Wiegen Sie 150 g des Bodens in die 2 separaten Behälter. Einen Container sollten wie die Probe Behandlung beschriftet werden, die mit Nährstoffen, um die rasante Verbreitung der Organismen fördern geändert wird. Beschriften Sie den anderen als das Steuerelement, das unverändert sein wird.

Berechnen Sie den Wassergehalt im Boden, mit Hilfe der Technik in dieser Sammlung Bestimmung der Feuchtigkeitsgehalt im Boden video gezeigt. Basierend auf dieser Berechnung, bestimmen Sie die Menge des Wassers im Boden auf einer trockenen Gewicht-Basis. Jetzt berechnen Sie die Menge des Wassers, das muss hinzugefügt werden, um eine 15 % Bodenfeuchte zu geben. Damit die Feuchtigkeit bei Feldkapazität, optimal für das Wachstum von Mikroorganismen.

Messen Sie die berechnete Menge destilliertes Wasser mit einem Messzylinder. Gießen Sie das berechnete Volumen des Wassers in jedem Behälter. Basierend auf den zuvor festgelegten Trockengewicht des Bodens, berechnen Sie die Menge an Glucose benötigt, um eine endgültige Boden Glukosekonzentration von 1 % zu erreichen von Masse, mit der trockenen Gewicht-Basis. Wiegen Sie diese Menge an Glukose und die Behandlung nur Container hinzufügen.

Wiegen Sie 200 mg von Ammoniumnitrat, dann fügen Sie es zum Container nur Behandlung. Das Ammoniumnitrat dient als stickstoffhaltige Nährstoffquelle für die Bodenmikroben. Mischen Sie der Boden, Glukose und Ammoniumnitrat-Mischung im Behälter.

Als nächstes 4 saubere Objektträger beschriften: zwei als Behandlung und zwei als Kontrolle. Die beiden Treatment-Folien in der Behandlung Boden Container einsetzen. Lassen Sie einen Abschnitt auf jeder Folie über der Bodenoberfläche ausgesetzt, und sicherstellen Sie, dass eine Lücke zwischen den beiden Folien klafft.

Stecken Sie die beiden Folien in Boden Steuerelementcontainer auf die gleiche Weise. Die Tassen mit Plastikfolie abdecken und mit einem Gummiband befestigen. Stechen Sie die Plastikfolie mehrmals Luft-Übertragung zu ermöglichen, aber noch verhindern, dass übermäßige Verdampfung.

Schließlich wiegen Sie beide Tassen, erfassen Sie ihr Gewicht, und sieben Tage in einem bestimmten Bereich bei Raumtemperatur inkubieren.

Berechnen Sie nach sieben Tagen Inkubation die Bodenfeuchte durch wiegen die Boden-Cups. Festzustellen Sie, ob Gewicht durch Verdunstung verloren gegangen ist, und ersetzen Sie das Wasser, wenn nötig.

Entfernen Sie die Plastikfolie aus dem Behälter zu, und entfernen Sie die beiden Folien aus dem Boden durch Drücken auf jeder Folie in eine Schräglage und zurückziehen, so dass die obere Fläche der Folie ungestört ist.

Klopfen Sie leicht die Folien um große Schmutzpartikel zu entfernen. Mit einem feuchten Papiertuch reinigen Sie die untere Fläche der Folien. In einer Dampfhaube bei Zimmertemperatur trocknen lassen. Einmal trocken Sie, holen Sie eine Folie mit Zange und in Essigsäure für 1 bis 3 min eintauchen.

Spülen Sie den oberen Rand der Folie mit einem sanften Strom von destilliertem Wasser, überschüssige Säure zu entfernen. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Folien. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen.

Unterstützen Sie die Folie auf eine Färbung Rack über einem Behälter überschüssige Farbstoff zu fangen. Bedecken Sie mit Hilfe einer Pipette, sanft die Oberfläche der einzelnen Folien mit phenolischen Rose Bengal Farbstoff. Lassen Sie die Folien, für 5 bis 10 min, kümmert sich um mehr Farbstoff wie notwendig, um die Folien nass halten hinzufügen zu beflecken. Sanft spülen Sie die Folien mit Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen, und lassen Sie die Folien bei Raumtemperatur trocknen.

Untersuchen Sie die Folien auf einem Lichtmikroskop mit objektiver Öl eintauchen. Die behandelte Boden haben mehr Bodenmikroben.

Die räumlichen Interaktionen zwischen Pilz- und bakterielle Organismen in typischen Bodenproben können leicht visualisiert werden. Erde-Teilchen zeigen dunkle unregelmäßige Formen.

Pilzorganismen zeigen Dicke filamentöse Hyphen, während Aktinomyceten dünne filamentöse Hyphen anzuzeigen.

Bakterien sind als kleine Kokken oder Stab Formen, in der Regel in Klumpen an Bodenpartikel oder Futter pilzliche Hyphen gefunden.

Die direkte Isolierung von Organismen aus dem Boden ist wichtig für das Verständnis der Eigenschaften von Boden und Umwelt.

Enthopathogenische Nematoden sind mikroskopisch kleine Runde Würmer, die Insekten parasitieren. Während sie nicht in den Kontakt Folie Assay visualisiert werden, können sie aus gesammelten Bodenproben, isoliert werden, wie im folgenden Beispiel gezeigt.

Zunächst wurden die Nematoden im Boden mit Insekten durch Sichtprüfung nicht identifiziert geködert. Nematoden wurden isoliert von den toten Insekten Köder, indem man toten Insekten in einer feuchten und dunklen Umgebung und ermöglicht die Nematoden, in das umgebende Wasser wandern. Die Nematoden wurden dann aus dem Wasser gesammelt und analysiert.

Filamentöse Pilze sind entscheidend für die Bodengesundheit aufgrund ihrer Rolle in Nährstoff recycling. Die Isolation und die Beobachtung der filamentöse Pilze aus dem Boden wurde in diesem Beispiel durchgeführt.

Bodenproben wurden mit Wasser verdünnt, und hinzugefügt, um sterile Rose Bengal Streptomycin Agarplatten zu trennen. Das Streptomycin verhindert Bakterienwachstum und Pilzwachstum aktiviert. Pilzartige Kolonien wurden gezählt und auf einem Objektträger mit Klebeband befestigt. Die Pilze wurden dann mit einem Lichtmikroskop abgebildet.

Natürlich brechen Bodenmikroorganismen Komponenten im Boden, wie abgestorbene Pflanzen und Organismen. Biologischer Abbau und Kolonisierung der biologisch abbaubare Kunststoff-Folien wurde untersucht, wie im folgenden Beispiel gezeigt.

Pilze wurden isoliert von Kunststoff-Folien für mehrere Monate im Boden vergraben. Die Pilze wurden dann einzeln für Wachstum auf Kunststoff-Folien getestet. Kunststoff-Folien wurden dann mit dem ausgewählten Pilz Stamm mit kein Wachstumsmedium inkubiert, um direkten Abbau des Plastiks von den Pilzen zu beobachten.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Kontakt Folie Assays für die qualitative Bildgebung von Bodenmikroben beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wie die Kontakt Folie vorbereiten und visualisieren Bodenmikroben. Danke fürs Zuschauen!

Results

Pilze zeigen Dicke, faserigen Hyphen (Abbildung 2). Aktinomyceten anzeigen dünne, filamentöse Hyphen. Bakterien zeigen kleine Kokken oder Stab Formen. Sie sind oft in Büscheln an Bodenpartikel oder Futter pilzliche Hyphen gefunden. Erde-Teilchen zeigen unregelmäßige, dunkle Formen (Abbildung 3).

Figure 2
Abbildung 2. Kontaktieren Sie Diabild mit 100 X Objektiv.
Foto mit freundlicher Genehmigung w.h. Fuller.

Figure 3
Abbildung 3. Kontaktieren Sie Diabild mit 100 X Objektiv.
Foto mit freundlicher Genehmigung w.h. Fuller.

Applications and Summary

Kontakt Folie-Assay, auch bezeichnet als begraben-Folie, ist eine einfache Technik genutzt, um qualitativ Bodenlebewesen beobachten. Dieser Test zeigt qualitativ die räumlichen Interaktionen zwischen pilzliche Hyphen, gelangte Filamente, Bakterien und Schmutzpartikel. Einzelpersonen oder Industrie kann dieser Test wissen auf einem bestimmten Boden Gesundheit in Bezug auf die Landwirtschaft, zu sammeln beschäftigen, Gartenarbeit, Kompostierung, Lehre und Studium. Diese Technik zu Mikro Bodenlebewesen, jedoch nicht quantifizieren, da es nur ein kleines Portrait von einer größeren heterogenen Umgebung umfasst.

Boden Organismus Beziehungen können beobachtet werden, indem Sie Kontakt Folie Test ausführen und Anzeigen der Ergebnisse durch 100 X Öl Immersion Mikroskopie (Abbildungen 2 und 3). Der Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit für die Durchführung dieses Tests ist es eine tolle Technik für diejenigen, die nie Mikrobiologie ausgesetzt waren und möglicherweise anzeigen Mikroorganismen durch ein Mikroskop zum ersten Mal.

References

  1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
  2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
  3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

1. Folie Mikrokosmos Bodenbearbeitung

  1. Gartenerde zu sammeln, von der Oberfläche (0-6 "Tiefe), und wiegen 150 g Boden in zwei separaten Tassen.
    1. Wenn Boden hohen Dichte an organischer Substanz hat, wiegt 100 g.
  2. Beschriften Sie eine Tasse "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
  3. Berechnen Sie die Menge an Wasser benötigt, um Feuchtigkeit-Inhalt zu verändern.
    1. Feuchtigkeit-Inhalt ist oft in der Nähe von Feldkapazität.
      Equation 1 1
  4. Maßnahme Menge von destilliertem Wasser mit einem Messzylinder.
  5. Zwei Fläschchen Gießen Sie Menge von destilliertem Wasser.
  6. Label ein Fläschchen "Behandlung" und die anderen "Kontrolle."
  7. Ändern Sie das Wasser in der "Behandlung" Durchstechflasche mit genügend Glukose für eine endgültige Boden Glukosekonzentration von 1 %, nach einer trockenen Gewicht-Basis im Boden "Behandlung".
  8. 200 mg NH4Nr.3 in der "Behandlung" Fläschchen und rühren um die Änderungen zu lösen. Das Nitrat dient als Stickstoffquelle von Nährstoffen für die Bodenmikroben.
  9. Ändern Sie das "Control"-Fläschchen nicht.
  10. In kleinen Aliquote von etwa 50 mg Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Behandlung" in die "Behandlung"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
  11. In kleinen Aliquote Mischen der Inhalt der Durchstechflasche "Control" in der "Control"-Tasse. Rühren Sie mit einem Spatel nach jeder Aliquote Zugabe.
  12. Vier saubere Objektträger beschriften: zwei "Behandlung" und zwei "Steuern" Folien.
  13. Stecken Sie die beiden Folien "Behandlung" in der "Behandlung" Boden-Cup, und stecken Sie die beiden "Control"-Folien in der "Control" Boden-Cup. Lassen Sie 2 cm auf jeder Folie über der Bodenoberfläche zu projizieren, und achten Sie darauf, eine Lücke zwischen den beiden Folien zu verlassen.
  14. Die Tassen mit Plastikfolie abdecken und mit einem Gummiband befestigen.
  15. Punktion der Wrap mehrmals, damit die Luft, aber nach wie vor übermäßiger Verdunstung zu verhindern.
  16. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
  17. 7 Tage inkubieren Sie die Erde gefüllten Tassen bei Raumtemperatur in einem dafür vorgesehenen Bereich/Inkubator.

2. Folie Färbung und Mikroskopie

  1. Nehmen Sie das Gewicht der beiden Tassen.
  2. Berechnen Sie die Bodenfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Folie entfernen.
  3. Entfernen Sie die beiden Folien aus jede Tasse indem Sie auf jeder Folie in eine Schräglage und zurückziehen, so dass die obere Fläche der Folie nicht gestört wird.
  4. Identifizieren Sie und markieren Sie die Seite des Schlittens gebeizt und beobachtet werden.
  5. Klopfen Sie leicht die Folien auf der Bank-Oberseite, große Schmutzpartikel zu entfernen.
  6. Mit einem feuchten Papiertuch reinigen Sie die untere Fläche der Folien. Trocknen Sie die Folien bei Zimmertemperatur.
  7. Schutzbrille trägt und hält jede Folie mit der Pinzette, tauchen die Folien in 40 % (V/V) Essigsäure für 1-3 min unter einem Abzug.
  8. Waschen Sie die überschüssige Säure unter einem sanften Strahl des Wassers.
  9. Bedecken Sie mit Hilfe einer Tropfflasche, die Oberfläche der Folien mit phenolischen Rose Bengal. Unterstützen Sie die Folie auf einem Färbung Gestell über einen Behälter, den überschüssige Fleck zu fangen. Seien Sie vorsichtig, nicht mit Kraft, die Mikroorganismen von der Oberfläche der Folien entfernen kann waschen.
  10. Fleck, die Folien für 5-10 min. nicht lassen Sie die Folie werden, trocken. Mehr Fleck nach Bedarf hinzufügen.
  11. Waschen Sie vorsichtig die Folien um überschüssige Fleck zu entfernen.
  12. Lassen Sie die Folien bei Zimmertemperatur trocknen.
  13. Mit der Öl-Immersion-Ziel, beobachten Sie die Folie mit einem Mikroskop (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1. Eine Folie unter dem Mikroskop.

Die Beziehungen zwischen den verschiedenen Organismen und anorganischen Komponenten im Boden sind wichtig zum Verständnis Bodenveränderungen und Umweltbelastungen, aber können nicht ohne direkte Visualisierung aufgeklärt werden.

Boden, ein äußerst komplexes System ist ein Lebensraum für Millionen von verschiedenen Organismen. Die Region der Erde direkt um Pflanzenwurzeln insbesondere die Rhizosphäre genannt, enthält eine einzigartige Palette von Organismen, die durch die Wurzeln der Pflanzen direkt beeinflusst werden.

Die abiotische oder nicht-biologischen, Bestandteil der Rhizosphäre umfasst anorganische Partikeln bis hin in Größe und Form, die die Bodentextur beitragen. Der biotische oder biologischen, Anteil umfasst Pflanzenreste, Wurzeln, organischen Stoffen und Mikroorganismen.

Dieses Video veranschaulicht die direkte Visualisierung der biotischen und abiotischen Komponenten der Rhizosphäre Boden, um Faktoren, die die Bodenveränderungen zu verstehen und vorherzusagen Umweltbelastungen.

Mikroskopisch kleine Organismen sind in der Regel im Umkreis von Bodenporen Wasser befinden. Bakterien gehören zu den einfachsten und reichlichste Organismen im Boden zu präsentieren und finden sich in vielen Morphologien einschließlich Sphären genannt Kokken, Stäbchen genannt Bazillen und filamentösen Formen.

Pilzarten, wie Hefen und Schimmelpilzen, sind die zweithäufigste Organismen im Boden. Gemeinsam zerlegen und recyceln toter organischen Materie. Mikroskopischen filamentöse Pilze visuell unterscheiden sich von anderen Mikroorganismen, wie sie lange und verzweigte Hyphen besitzen, die Sporen freisetzen.

Direkter Beobachtung der Beziehungen zwischen diesen Organismen ist eine Herausforderung, aber mit einem Kontakt Folie Assay erreicht werden kann. Diese Methode wird durchgeführt, indem Sie eintauchen einen Objektträger in Boden für mehrere Tage und die Organismen und Bodenteilchen zu adsorbieren an die Oberfläche der Folie.

Die Folie wird dann schräg gegen Verschmieren der Oberfläche entfernt. Die Mikroben sind mit Essigsäure fixiert und gefärbt mit Rose Bengal Fleck, Visualisierung über Lichtmikroskopie zu ermöglichen.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter den Kontakt Folie-Assay-Technik zu verstehen, werfen wir einen Blick auf den Prozess im Labor.

Zunächst sammeln Sie Oberfläche Gartenerde und übertragen Sie den Boden ins Labor zu. Wiegen Sie 150 g des Bodens in die 2 separaten Behälter. Einen Container sollten wie die Probe Behandlung beschriftet werden, die mit Nährstoffen, um die rasante Verbreitung der Organismen fördern geändert wird. Beschriften Sie den anderen als das Steuerelement, das unverändert sein wird.

Berechnen Sie den Wassergehalt im Boden, mit Hilfe der Technik in dieser Sammlung Bestimmung der Feuchtigkeitsgehalt im Boden video gezeigt. Basierend auf dieser Berechnung, bestimmen Sie die Menge des Wassers im Boden auf einer trockenen Gewicht-Basis. Jetzt berechnen Sie die Menge des Wassers, das muss hinzugefügt werden, um eine 15 % Bodenfeuchte zu geben. Damit die Feuchtigkeit bei Feldkapazität, optimal für das Wachstum von Mikroorganismen.

Messen Sie die berechnete Menge destilliertes Wasser mit einem Messzylinder. Gießen Sie das berechnete Volumen des Wassers in jedem Behälter. Basierend auf den zuvor festgelegten Trockengewicht des Bodens, berechnen Sie die Menge an Glucose benötigt, um eine endgültige Boden Glukosekonzentration von 1 % zu erreichen von Masse, mit der trockenen Gewicht-Basis. Wiegen Sie diese Menge an Glukose und die Behandlung nur Container hinzufügen.

Wiegen Sie 200 mg von Ammoniumnitrat, dann fügen Sie es zum Container nur Behandlung. Das Ammoniumnitrat dient als stickstoffhaltige Nährstoffquelle für die Bodenmikroben. Mischen Sie der Boden, Glukose und Ammoniumnitrat-Mischung im Behälter.

Als nächstes 4 saubere Objektträger beschriften: zwei als Behandlung und zwei als Kontrolle. Die beiden Treatment-Folien in der Behandlung Boden Container einsetzen. Lassen Sie einen Abschnitt auf jeder Folie über der Bodenoberfläche ausgesetzt, und sicherstellen Sie, dass eine Lücke zwischen den beiden Folien klafft.

Stecken Sie die beiden Folien in Boden Steuerelementcontainer auf die gleiche Weise. Die Tassen mit Plastikfolie abdecken und mit einem Gummiband befestigen. Stechen Sie die Plastikfolie mehrmals Luft-Übertragung zu ermöglichen, aber noch verhindern, dass übermäßige Verdampfung.

Schließlich wiegen Sie beide Tassen, erfassen Sie ihr Gewicht, und sieben Tage in einem bestimmten Bereich bei Raumtemperatur inkubieren.

Berechnen Sie nach sieben Tagen Inkubation die Bodenfeuchte durch wiegen die Boden-Cups. Festzustellen Sie, ob Gewicht durch Verdunstung verloren gegangen ist, und ersetzen Sie das Wasser, wenn nötig.

Entfernen Sie die Plastikfolie aus dem Behälter zu, und entfernen Sie die beiden Folien aus dem Boden durch Drücken auf jeder Folie in eine Schräglage und zurückziehen, so dass die obere Fläche der Folie ungestört ist.

Klopfen Sie leicht die Folien um große Schmutzpartikel zu entfernen. Mit einem feuchten Papiertuch reinigen Sie die untere Fläche der Folien. In einer Dampfhaube bei Zimmertemperatur trocknen lassen. Einmal trocken Sie, holen Sie eine Folie mit Zange und in Essigsäure für 1 bis 3 min eintauchen.

Spülen Sie den oberen Rand der Folie mit einem sanften Strom von destilliertem Wasser, überschüssige Säure zu entfernen. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Folien. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen.

Unterstützen Sie die Folie auf eine Färbung Rack über einem Behälter überschüssige Farbstoff zu fangen. Bedecken Sie mit Hilfe einer Pipette, sanft die Oberfläche der einzelnen Folien mit phenolischen Rose Bengal Farbstoff. Lassen Sie die Folien, für 5 bis 10 min, kümmert sich um mehr Farbstoff wie notwendig, um die Folien nass halten hinzufügen zu beflecken. Sanft spülen Sie die Folien mit Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen, und lassen Sie die Folien bei Raumtemperatur trocknen.

Untersuchen Sie die Folien auf einem Lichtmikroskop mit objektiver Öl eintauchen. Die behandelte Boden haben mehr Bodenmikroben.

Die räumlichen Interaktionen zwischen Pilz- und bakterielle Organismen in typischen Bodenproben können leicht visualisiert werden. Erde-Teilchen zeigen dunkle unregelmäßige Formen.

Pilzorganismen zeigen Dicke filamentöse Hyphen, während Aktinomyceten dünne filamentöse Hyphen anzuzeigen.

Bakterien sind als kleine Kokken oder Stab Formen, in der Regel in Klumpen an Bodenpartikel oder Futter pilzliche Hyphen gefunden.

Die direkte Isolierung von Organismen aus dem Boden ist wichtig für das Verständnis der Eigenschaften von Boden und Umwelt.

Enthopathogenische Nematoden sind mikroskopisch kleine Runde Würmer, die Insekten parasitieren. Während sie nicht in den Kontakt Folie Assay visualisiert werden, können sie aus gesammelten Bodenproben, isoliert werden, wie im folgenden Beispiel gezeigt.

Zunächst wurden die Nematoden im Boden mit Insekten durch Sichtprüfung nicht identifiziert geködert. Nematoden wurden isoliert von den toten Insekten Köder, indem man toten Insekten in einer feuchten und dunklen Umgebung und ermöglicht die Nematoden, in das umgebende Wasser wandern. Die Nematoden wurden dann aus dem Wasser gesammelt und analysiert.

Filamentöse Pilze sind entscheidend für die Bodengesundheit aufgrund ihrer Rolle in Nährstoff recycling. Die Isolation und die Beobachtung der filamentöse Pilze aus dem Boden wurde in diesem Beispiel durchgeführt.

Bodenproben wurden mit Wasser verdünnt, und hinzugefügt, um sterile Rose Bengal Streptomycin Agarplatten zu trennen. Das Streptomycin verhindert Bakterienwachstum und Pilzwachstum aktiviert. Pilzartige Kolonien wurden gezählt und auf einem Objektträger mit Klebeband befestigt. Die Pilze wurden dann mit einem Lichtmikroskop abgebildet.

Natürlich brechen Bodenmikroorganismen Komponenten im Boden, wie abgestorbene Pflanzen und Organismen. Biologischer Abbau und Kolonisierung der biologisch abbaubare Kunststoff-Folien wurde untersucht, wie im folgenden Beispiel gezeigt.

Pilze wurden isoliert von Kunststoff-Folien für mehrere Monate im Boden vergraben. Die Pilze wurden dann einzeln für Wachstum auf Kunststoff-Folien getestet. Kunststoff-Folien wurden dann mit dem ausgewählten Pilz Stamm mit kein Wachstumsmedium inkubiert, um direkten Abbau des Plastiks von den Pilzen zu beobachten.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Kontakt Folie Assays für die qualitative Bildgebung von Bodenmikroben beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wie die Kontakt Folie vorbereiten und visualisieren Bodenmikroben. Danke fürs Zuschauen!

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE