堆積物中のバイオ マーカーの抽出溶媒抽出を加速

Earth Science
 

Overview

ソース: ジェフ Salacup - マサチューセッツ大学アマースト校講座

グリセロール ジアルキル グリセロール tetraethers (GDGTs)、古細菌と細菌のスイート プロデュースと呼ばれる有機バイオ マーカーのグループの分布は、空気への応答で予測可能な方法で変更または水の温度1, 2現世堆積物で発見されました。したがって、知られている時代の堆積物のシーケンスでこれらのバイオ マーカーの分布は、千年に十年スケール (図 1) の空気や水の温度の進化を再構築する使用できます。古気候学と呼ばれる、過去の気候の長い高解像度記録の生産は、何百、何千ものサンプルの迅速分析に依存します。古い手法を超音波やソックスレーなどが遅いです。ただし、新しい溶媒抽出の高速化手法は効率を考慮して設計されました。

Figure 1
図 1。過去の間に東地中海の海面水温 (SST) の変化を示す古レコードの例 〜 27,000 年3.このレコード 〜 115 サンプルと isoprenoidal gdgt かかわらずベース TEX86 SST プロキシに基づいています。

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JoVE Science Education Database. 地球科学の本質. 堆積物中のバイオ マーカーの抽出溶媒抽出を加速. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

高速溶媒抽出は商標 (熱科学型) 高温 (~ 100 ° C) と圧力抽出処理の速度を増加する (〜 1,200 psi) を利用した抽出法です。溶剤抽出の高速化、または ASE (図 2) と呼ばれる、抽出は、最大 24 の個々 のサンプルを保持できます。ASE が読み込まれ、実行する設定、一度は完全に自動化します。ASE 全体抽出プロセスの電子制御が可能: 抽出温度、圧力、溶媒量、混合溶媒、期間、リンス、および繰り返しをサンプルからサンプルにすべての調整可能です。ほとんどの有機性地球化学研究所は溶媒抽出法の標準的な方法として ASE を使用します。

Figure 2
図 2。加速の溶媒抽出 (ASE)。

高速溶媒抽出は、多数の地質学的堆積物から有機バイオ マーカーを区切るために使用高速、効率的、かつ高スループットの手法です。

従来、超音波処理などソックスレー抽出メソッドを使用、ただし、これらのプロトコルの短所は、彼らが詳細な古環境復元のための十分な材料を処理する遅すぎることです。新しい技術、有機溶媒抽出の高速化、または ASE メソッドは、効率と高スループットを開発されました。

ASE メソッドでは、高温・高圧の組み合わせを使用して、サンプルを抽出することができます単一の複数のサンプルを実行、実行の準備を比較的高速。

このビデオは、堆積物からバイオ マーカーを抽出する方法を説明した一連の 3 番目です。それは手順をカバーし、超音波またはソックスレー抽出 ASE のメリットに洞察力を提供します。

高速溶媒抽出サンプルはカルーセルに読み込まれるし、鋼板セルに読み込まれます。サンプルの各セルのコレクション バイアルも専用のターン テーブルに読み込まれます。楽器は、サンプル細胞を内部オーブンに読み込みます。溶剤は、十分な圧力に達するまでバルブのシリーズを通して溶媒ボトルから注入されます。

この圧力の時間サンプルや試料が指示が行われます。その後、溶剤が対応するコレクション バイアルにスチール線を試料容器からフラッシュされます。プロセスは、回数を繰り返します。温度、圧力、および期間をサンプルのカスタマイズできます。

高温使用増加抽出の動力学高圧は、溶剤が揮発するを防ぎます。コレクション バイアルが含まれています総脂質抽出物にはおよび残渣と呼ばれる試料容器に残っているもの。非有機材料としては溶媒抽出、ケロジェンと呼ばれる有機物を装備されています。

今では私たちは高速溶媒抽出の背後にある原理に精通している、どのように研究室で実施していますでみましょう。

関心のサンプルを採取フリーズドライ、均質化と、このシリーズの別のビデオに示すように染します。

すべてのサンプルが準備されると、抽出されるごとに 1 つのセルと 1 つの空白のための余分を組み立てます。これを行うには、細胞体にエンド キャップをネジします。溶剤洗浄のピンセットを使用して、1 つずつ上に燃焼ガラス繊維フィルターを配置します。ゆっくりと優しくピストンを持つフィルターを押し下げます。

ラベルの各サンプルの数によって細胞体と別に空白をラベルします。実験室規模、風袋を計りの上に錫の重量を量る燃焼を配置します。溶剤でヘラをすすぎ、サンプルの 5-10 g を計量の錫に転送する使用し、質量を記録します。

計量の錫のすべての材料をその対応するセルに転送します。上に、別のガラス繊維フィルターを置き、サンプルの上部に到達するまでに軽く詰めます。

それがほぼいっぱい、細胞体のスレッドに破片を避けるために注意されるまで分散剤、砂、珪藻土などを追加します。別のエンド キャップとセルの上端をキャップします。各サンプルの空白には、この手順を繰り返します。

対応するサンプル セルまたは空白の数と各コレクションのバイアルのラベルし、バイアル キャップとキャップします。上段の ASE トレイの番号のスロットに各セルを配置します。ASE をキーパッドを使用して 100 の ° C および 1,200 psi で抽出する抽出法のパラメーターを設定します。10 分の静的保持と 3 回の各サンプルを抽出し、静的な保持間総容積の 50% の細胞体をフラッシュします。

次に、溶媒ボトルにすべてのサンプルを抽出するのに十分が含まれていることを確認します。実行を開始する前に計測器ライン 3 回をすすいでください。最後に、開始を押します。

ASE からバイアルを削除します。バイオ マーカーが抽出されて、今では、解析の前に浄化されなければなりません。

高速溶媒抽出は、さまざまなアプリケーションでは、ここでいくつかの検討は利用できる汎用性の高いテクニックです。

高速溶媒抽出を含む食品サンプルの他のタイプの使用もできます。農薬汚染をテストする残留分析は、規制、産業設備、安全と果物や野菜などの食品の品質を確認するためによく行われます。ASE は、食品サンプルから有機塩素系農薬を抽出し、型または残留物農産物の現在のレベルを決定する使用できます。この情報は、人間や動物の消費のための食材を収まるかどうかを確立する使用できます。例えば、製品によって、百万の食品ごとに 0.1 0 パーツ内ディルドリンを発見する必要があります。

食品の栄養成分は、ASE を使用して抽出することができます。たとえば、高重量脂肪の内容があるかもしれません、チョコレートのような製品を抽出できます。石油エーテルを溶媒として ASE を使用、脂肪チョコレートのサンプルから分離できチョコレートの既知量の正確な割合脂肪含有量を決定する定量分析を受けます。この情報を使用して、規制機関は、チョコレート メーカーの主張を確認できます。 またはメーカーが正確な食品のラベルを作成するための情報を取得できます。

高速溶媒抽出または ASE を使用して脂質バイオ マーカーの抽出にゼウスの導入を見てきただけ。それに続くビデオでさらに処理および分析のための方法を見つけることが。

見てくれてありがとう!

Procedure

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1. 必要な資料の収集

  1. サンプルを抽出します。(この場合は堆積物) のサンプルは凍結、凍結乾燥、粉砕と抽出、前に均質化、効率を最大にするグループで抽出します。
  2. サンプルのサイズ、に応じて 40 または 60 mL のボリューム コレクション バイアルを使用します。この実験では、ホウケイ酸ガラスの瓶 (40 mL) と溶剤の安全キャップを使用します。燃焼バイアル、ホウケイ酸ガラス ピペットおよび 550 ° C、6 h 可能な有機汚染物質の除去を確実に事前に計量缶。
  3. ほとんどの有機地球化学研究室では、ジクロロ メタン (DCM) とメタノールを共通です。それらを個別に使用して、(メタノール最初、DCM が続く) 実験室のツールと使用前にガラスを洗浄します。多くのラボでメタノール (メタノール; 9:1) ジクロロ メタンの混合物を使用することで、効率的に極性の広い範囲でバイオ マーカーを抽出します。溶剤は、有機汚染物質の無料する必要があります。
  4. この実験に使用する加速の溶媒抽出を取得します。

2. サンプル細胞の調製

  1. 各サンプルを抽出するためのサンプル細胞に加えて、1 つの空白を組み立てます。
    1. 各セルの細胞体の一方の端に端点キャップをネジします。
    2. 燃焼ガラス繊維フィルターを溶剤洗浄のピンセットを使用して各セルの上に配置します。その後、静かにゆっくりをフィルター プランジャーを使用しているセルにフィルターを押し下げます。
    3. ラベルの番号 (例: 1-22) 各サンプルの細胞体と、空白のセルに「空白」を書きます。
    4. 珪藻土 (または砂) で空白を塗りつぶすし、2 番目のエンド キャップとキャップします。手で締めます。

3. 試料の調製

  1. ラボ ・風袋錫の重量を量る燃焼を配置します。
  2. 洗浄溶剤、ラボへら計量錫に適切なサンプル量を転送するためにそれを使用し、質量を記録します。
    1. 試料の質量は、その有機物の含有量によって異なります。有機物豊富な材料 (葉組織) が、はるかに少ない必要ですが、比較的有機物の無駄のない材料 (海泥) は数グラムを必要があります。
  3. 準備された ASE セルにすべての計量のブリキ缶に材料を転送します。
  4. セルの上に別のガラス繊維フィルターを配置し、フィルターのプランジャーを使用してサンプルの上部に到達するまでゆっくりと優しく押してダウン。
  5. それがほぼいっぱいまでのセルに珪藻類地球 (または砂) を追加します。細胞体のスレッドから任意の残骸を削除する注意してください。
  6. 別のエンド キャップとセルの上端をキャップします。
  7. 各サンプルの 3.1 3.6 の手順を繰り返します。

4. コレクション バイアルの作製

  1. 対応するセル (例えば1-22 または空) と ASE コレクション バイアル キャップとキャップの数と各バイアルにラベルを付けます。

5. 抽出

  1. 上段の ASE トレイの番号のスロットに各サンプル セルを配置します。
  2. 低い ASE 皿に同じ数のスロットに対応するコレクション バイアルを配置します。
  3. ASE のキーパッドを使用して抽出を作成します。100 ° C で 1,200 psi を抽出します。抽出は、各サンプル 3 x 10 分の静的保持と静的な保持間総容積の 50% の細胞体をフラッシュします。
  4. 溶媒ボトルにすべてのサンプルを抽出する十分な溶剤が含まれていることを確認します。
  5. リンス ASE 3 x ASE コントロール パッドの「すすぎ」ボタンを押して実行を開始する前に。
  6. スタートを押します。

Results

抽出の最後には、各サンプルの総脂質抽出 (TLE) があります。各バイアルには、底質、土壌、または植物組織から抽出される有機物が含まれています。これら TLEs を分析してその成分を識別して定量化します。

Applications and Summary

抽出したサンプルの TLEs には古代温度を再構築に使用する GDGTs を含む別の有機化合物の広い範囲が含まれます。グリセロール ジアルキル グリセロール-tetraethers は、成長温度への感受性を示すバイオ マーカーの広いスイートです。GDGTs、分岐し、イソプレノイド、コア アルキル基(図 3に分岐パターンの特徴の異なる 2 つのグループがある)。海では、タウムアーキオータと呼ばれる古細菌の国際的なグループは、isoprenoidal GDGTs4を生成します。分岐した GDGTs は、土地土壌5湖、湖堆積物6アシドバクテリウム門7、まだ正体不明の細菌によって生産されています。古細菌と細菌の両方調整リング、メチル枝物の成長温度によるとコアのアルキル基の数とそれらを使用して気候変動の長い高解像度記録を生成する GDGTs は数百万年の堆積物で安定しているので。

TEX86古水温度プロキシは、そのコアのアルキル基 (図 3) で 86 の炭素原子を含む各特定の isoprenoidal、GDGTs の比率に基づいています。

TEX86 = (gdgt かかわらず 2 + gdgt かかわらず 3 + gdgt かかわらず 4')/
(GDGT かかわらず 4 GDGT かかわらず 3 + GDGT かかわらず 2 GDGT かかわらず 1')

古水温は、元の方程式など、調整を使用して、推論されます。

TEX86 = 0.015T + 0.28 (R2 = 0.92)

スカウテンによって提案されました。1、ここで T は温度。いくつかの他の地域や地方の校正は、たとえば大きい湖でまたは熱帯で使用するためのプロキシを絞り込むに開発されています。

Figure 3
図 3。Isoprenoidal と分岐 GDGTs の化学構造この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

References

  1. Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters204(1-2), 265-274 (2002).
  2. Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta71(3), 703-713 (2007).
  3. Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
  4. Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
  5. Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters224(1-2), 107-116 (2004).
  6. Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry40(9), 1032-1036 (2009).
  7. Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).
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1. 必要な資料の収集

  1. サンプルを抽出します。(この場合は堆積物) のサンプルは凍結、凍結乾燥、粉砕と抽出、前に均質化、効率を最大にするグループで抽出します。
  2. サンプルのサイズ、に応じて 40 または 60 mL のボリューム コレクション バイアルを使用します。この実験では、ホウケイ酸ガラスの瓶 (40 mL) と溶剤の安全キャップを使用します。燃焼バイアル、ホウケイ酸ガラス ピペットおよび 550 ° C、6 h 可能な有機汚染物質の除去を確実に事前に計量缶。
  3. ほとんどの有機地球化学研究室では、ジクロロ メタン (DCM) とメタノールを共通です。それらを個別に使用して、(メタノール最初、DCM が続く) 実験室のツールと使用前にガラスを洗浄します。多くのラボでメタノール (メタノール; 9:1) ジクロロ メタンの混合物を使用することで、効率的に極性の広い範囲でバイオ マーカーを抽出します。溶剤は、有機汚染物質の無料する必要があります。
  4. この実験に使用する加速の溶媒抽出を取得します。

2. サンプル細胞の調製

  1. 各サンプルを抽出するためのサンプル細胞に加えて、1 つの空白を組み立てます。
    1. 各セルの細胞体の一方の端に端点キャップをネジします。
    2. 燃焼ガラス繊維フィルターを溶剤洗浄のピンセットを使用して各セルの上に配置します。その後、静かにゆっくりをフィルター プランジャーを使用しているセルにフィルターを押し下げます。
    3. ラベルの番号 (例: 1-22) 各サンプルの細胞体と、空白のセルに「空白」を書きます。
    4. 珪藻土 (または砂) で空白を塗りつぶすし、2 番目のエンド キャップとキャップします。手で締めます。

3. 試料の調製

  1. ラボ ・風袋錫の重量を量る燃焼を配置します。
  2. 洗浄溶剤、ラボへら計量錫に適切なサンプル量を転送するためにそれを使用し、質量を記録します。
    1. 試料の質量は、その有機物の含有量によって異なります。有機物豊富な材料 (葉組織) が、はるかに少ない必要ですが、比較的有機物の無駄のない材料 (海泥) は数グラムを必要があります。
  3. 準備された ASE セルにすべての計量のブリキ缶に材料を転送します。
  4. セルの上に別のガラス繊維フィルターを配置し、フィルターのプランジャーを使用してサンプルの上部に到達するまでゆっくりと優しく押してダウン。
  5. それがほぼいっぱいまでのセルに珪藻類地球 (または砂) を追加します。細胞体のスレッドから任意の残骸を削除する注意してください。
  6. 別のエンド キャップとセルの上端をキャップします。
  7. 各サンプルの 3.1 3.6 の手順を繰り返します。

4. コレクション バイアルの作製

  1. 対応するセル (例えば1-22 または空) と ASE コレクション バイアル キャップとキャップの数と各バイアルにラベルを付けます。

5. 抽出

  1. 上段の ASE トレイの番号のスロットに各サンプル セルを配置します。
  2. 低い ASE 皿に同じ数のスロットに対応するコレクション バイアルを配置します。
  3. ASE のキーパッドを使用して抽出を作成します。100 ° C で 1,200 psi を抽出します。抽出は、各サンプル 3 x 10 分の静的保持と静的な保持間総容積の 50% の細胞体をフラッシュします。
  4. 溶媒ボトルにすべてのサンプルを抽出する十分な溶剤が含まれていることを確認します。
  5. リンス ASE 3 x ASE コントロール パッドの「すすぎ」ボタンを押して実行を開始する前に。
  6. スタートを押します。

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