使用光学和共聚焦显微镜成像生物样本

Biomedical Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Overview

资料来源佩曼·沙贝吉-鲁德波什蒂和西娜·沙赫巴兹莫哈马迪,康涅狄格大学生物医学工程系,康涅狄格州斯托尔斯

光学显微镜已经存在了几个世纪,虽然几十年前它们达到了分辨率的理论极限,但新的设备和技术,如共聚焦和数字图像处理,在光学领域创造了新的利基。成像。最好的光学显微镜在理想条件下的分辨率通常低于200nm。然而,光学显微镜受到波衍射的限制,波的波长函数为可见光约500nm。虽然光学显微镜的分辨率没有达到电子显微镜,但它们是生物宏观结构成像中最有价值的工具,是任何生物实验室的主食。

在传统的光学显微镜中,从成像物体产生的信号来自标本的全部厚度,这不允许它的大部分被聚焦到观察者。这将导致图像具有"焦点外模糊"。另一方面,共聚焦显微镜通过针孔照亮样品,因此能够从物体焦点的上方和下方过滤出失焦光。

本演示介绍了使用光学和共聚焦显微镜方法的图像采集。在这里,将研究一块被分割的老鼠大脑。 将涵盖图像采集和分析,包括生成地形图和合成图像的工具。还将讨论不同成像方法在分辨率、焦点深度和样本类型方面的优缺点。本演示的目的是提供有关光学和共聚焦显微镜的更多信息,以确定这些显微镜模块是否适合某种生物样品。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生物医学工程. 使用光学和共聚焦显微镜成像生物样本. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

光学显微镜使用至少两个放大元件功能。主透镜(称为目标)确定总放大倍率,而称为目镜的辅助镜头聚焦虚拟图像以进行查看。总放大倍数是通过乘以两个镜头的放大倍数来确定的。通过这些光源对光的对焦,加上从灯到样品的光对焦,为放大倍率和灯灯都在同一点相遇,从而给出图像的最佳分辨率。下图演示了标本的焦点平面如何通过不同的透镜产生。由于照明面积较大,焦平面外的对象将具有来自样品其他部分的光束干扰。这会导致图像中模糊。因此,要聚焦于高度差异很大的样本的不同 z 位置,必须将 z 方向切片移动到焦平面中。

Figure 1
图 1.光学显微镜透镜和焦平面。

数字显微镜与光学微镜的原理相同,只不过它不依赖于目镜。这是一台装有数码相机的光学显微镜。数码相机充当探测器,图像显示在计算机监视器上。这些显微镜非常适合在研发(研发)、制造和检测、质量控制和保证 (QC/QA) 以及故障分析 (FA) 期间分析和记录样品。他们通常提供允许用户分析示例图像的软件。图 2 显示了典型的数字显微镜设置。

Figure 2
图 2.数字显微镜的主要部件。

该系统的主要组件包括:

  1. 光学引擎:包含用于放大图像的图像采集传感器和镜头。
  2. 目的:从样品中获取和聚焦光线。三个不同的目标可用于各种图像采集任务。
  3. 扫描阶段:样品放置位置。
  4. 显微镜支架:为光学引擎和扫描级提供支持。还控制附加组件与计算机之间的通信。
  5. 计算机:支持用户软件,允许在监视器上查看图像。
  6. 控制器:使用多点触控手势和触摸感应的上下文特定图标控制显微镜和工作流程。控制旋钮控制变焦、对焦和显微镜图像位置。

共聚焦显微镜或共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 是具有更高的光学分辨率和对比度的显微镜。共聚焦意味着"具有相同的焦点"。对象及其图像为"共聚焦"。

Figure 3
图 3.模糊及其对图像的影响。左图显示边缘模糊的焦点外图像。右图演示了在成像对焦样本时穿过镜头的光路径。

与一般光学显微镜照亮和成像整个样品的视图相反,共聚焦显微镜利用样品级和探测器之间的针孔,以便一次只聚焦一个狭窄的深度水平的较小光束。因此,样本的唯一可见区域是焦点。然后,共聚焦显微镜用这种更聚焦的光束(或激光)扫描样品表面。然后,数据被组装成一个 2D 图像,其分辨率优于经典光学显微镜。此外,由于光线集中在非常狭窄的高度范围内,因此当 Z 方向移动时,用户可以将不同的平面置于焦点上。通过图像处理技术和自动化软件共聚焦显微镜辅助多平面聚焦复合图像的三维重建。

共聚焦显微镜能够通过图像处理提供以前在光学显微镜中不可用的样品的 Z 方向数据。例如,在下面描述的演示中,用户可以定义样本的上部和下部焦点范围,然后不仅开发显示 z 方向测量值的热图,而且还创建一个复合图像,在重点。这些功能在获取有关示例的三维数据时特别有用。

Figure 4
图 4.共聚焦显微镜的主要成分。

共聚焦显微镜的主要组件包括:

  1. 带精细 Z 驱动器和 400 万像素摄像头的扫描头,使用粗 Z 驱动器站立
  2. 目标:2.5x/5x/10x/20x/50x/100x
  3. 阶段:扫描阶段和固定阶段
  4. 计算机系统:PC系统成像软件
  5. 控制器: x, y, z 运动

Procedure

1. 共聚焦成像

  1. 将样品加载到舞台上。将其居于镜头下方。它不应超过阶段的重量限制,在这种情况下为 5 kg。样品厚度不应超过 100 mm。
  2. 打开成像软件并选择"创建作业"。
  3. "地形列"下,选择"辅助"按钮。
  4. 以最低放大倍数 2.5 倍创建概览图像。在切换放大倍率之前,通过更改 Z 位置确保样本处于焦点,直到看到清晰的图像。这可以通过向下推或拉起 3D 显微镜操纵器来实现。通过接合侧面的按钮,可以实现更精细的 Z 运动,从而在边缘周围产生蓝光。
  5. 慢慢增加镜头放大倍率,持续播放光强和对焦,直到达到所需的放大倍数。如果需要,使用操纵器在 x 和 y 方向移动舞台,选择其他感兴趣区域。
  6. 以低倍率拍摄概览图像后,按下一个按钮继续参考点步骤。如果需要,请指定某个参考点进行测量(即样品的角),但为此而言,默认参考点可以。
  7. 点击下一个箭头以继续向导的下一部分。
  8. 根据需要更改目标以查看适合您的样本的分辨率。在这种情况下,50X 物镜用于可视化样品中的细胞。50X 是最接近样品的镜头,因此逐渐移动到 50X 目标,确保 20X 镜头后仍有空间缩短工作距离。
  9. 在"测量范围定义"页上,稍微移动 Z 位置(单击操纵器上的侧边按钮进行微调),以便只有样本顶部处于焦点位置,然后单击"设置最后一个"。然后按 Z 方向(向下)移动舞台,直到只有样本的最底部处于焦点,然后按"先设置"。确保计算切片数不超过 1000,否则程序将失败。
  10. 确保光线强度不会在任何级别的图像中过度饱和(导致红色像素),然后点击完成。这将拍摄断层扫描图像并打开断层扫描软件。
  11. 在断层扫描软件中,打开"研究"选项卡等选项卡,以 3D 格式查看数据并在 2D 或 3D 空间中进行测量。

2. 数字光学显微镜成像

  1. 将样品加载到舞台上。将样品居中到镜头下方。样品重量不应超过阶段的重量限制,在这种情况下为 4 kg。样品不应高于 12 厘米。
  2. 打开成像软件。
  3. 从提供的模板列表中选择作业。也可以通过按免费考试在工作之外工作,这样您可以研究工作以外的样本。
  4. 获取显示整个阶段的概览图像。这将作为稍后的地图,以显示正在查看的示例部分。获取图像时,使用控制器更改焦点和图像位置。
  5. 放置坐标系。默认坐标系来自舞台的左后角,适合此应用程序。如果样本弯曲,您可以在此处调整坐标。
  6. 命名示例和作业,这会将其添加到作业列表中,以便其他用户可以返回到该列表。
  7. "获取"下选择"相机"按钮。拍摄初始图像,然后在导航示例时按实时按钮。
  8. 向下移动焦点,直到样本明显聚焦。可能还需要在"照明和光圈"选项卡下调整照明。
  9. 使用"图像优化"面板下的工具优化图像。您可以在"图像增强"选项卡下玩不同的参数,例如镜头的倾斜度、样品上的照明级别以及亮度和对比度,直到图像达到所需的清晰度。
  10. 通过点击软件上的铅笔工具执行测量。从那里,您可以访问多个测量工具,包括距离、角度和面积。使用距离和面积工具测量样本的大小。
  11. 转到"结果工作流"选项卡并检查工作流布局以配置报表的布局
  12. 点击"保存"按钮以保存作业,以便其他人可以使用相同的工作流。

显微镜是一种广泛用于成像样品详细结构的方法。光学显微镜通过一系列透镜聚焦光线以放大样品,在17世纪出现了第一台复合显微镜,已经使用了几个世纪。在此期间,Antonie van Leeuwenhoek 是第一个观察细菌、酵母、红血球和毛细血管循环的人,为微观发展做出了重大科学贡献。

光学显微镜至今仍广泛用于医学诊断的研究和临床设置。然而,在过去 60 年中,出现了共聚焦显微镜,通过针孔照亮样品,以提高光学分辨率和对比度。

本视频将说明光学和共聚焦显微镜的操作原理,展示如何分析高分辨率图像,并探讨显微镜在生物医学工程领域的几个应用。

让我们首先讨论共聚焦显微镜的基本原理。光学显微镜基于将光聚焦到样品上以成像其详细结构的原理。显微镜由两个放大元件组成;物镜,聚焦物体的真实图像,目镜,在眼睛接收之前聚焦放大的虚拟图像。总放大倍数是通过将这两个镜头的放大倍数乘以来实现的。

光的对焦为放大倍数和灯灯都在同一点相遇,从而给出指定的对焦平面,从而在图像中给出最佳分辨率。当在焦平面外部时,照明区域较大,光束会干扰样本的其他部分,导致图像模糊。当光学显微镜照亮并成像整个样品时,共聚焦显微镜利用样品级和探测器之间的针孔,以便一次只聚焦一个小光束。

因此,样本的唯一可见区域是焦点,提供解析良好的图像。但是,如果分辨率较高,则一次只能对此示例的一小部分进行成像。通过在 X-Y 平面中移动样品,可以对其表面进行栅格扫描。对于扫描的每个点,通过调整 Z 高度来访问不同的焦平面来优化焦点。这可确保图像样本的逐点分辨率最大化。

现在,让我们使用显微镜和图像分辨率的这些原则,使用共聚焦和光学显微镜对小鼠大脑进行成像。

在回顾了显微镜的主要原理后,现在让我们使用共聚焦显微镜进行测量。首先,打开计算机工作站的显微镜。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。现在打开映像软件并选择创建新作业。转到地形的列并选择辅助按钮。选择此显微镜的最低放大倍数为 2.5 倍。然后使用 3D 显微镜操纵器调整样品的 Z 位置,使样品聚焦。按下侧面的按钮,使边缘周围出现蓝光。这允许更精细的 Z 运动和对焦。现在捕获概览图像。

缓慢增加镜头放大倍率并调整光强和对焦以获得所需的放大倍率。使用 X 和 Y 方向中的 3D 操纵器在样品上选择不同感兴趣的区域。以低放大倍率拍摄图像后,按旁边取参考点。使用默认参考点,或在示例角指定新参考点,然后按下一步。现在逐渐将目标更改为样本所需的分辨率。对于这个样本,20x目标用于可视化小鼠脑组织中的细胞。确保有空间缩短工作距离。

要定义收集切片的距离,请先转到测量范围定义页,并使用 3D 操纵器最终调整 Z 方向的样本。当示例顶部处于焦点时,单击"上次设置";当示例底部处于焦点时,首先单击"设置"。确保计算切片数不超过 1,000 或程序将失败。验证没有红色像素,这表示光的强度过饱和。

最后,按完取断层扫描图像。打开断层扫描软件时,选择"算例"选项卡以 3D 格式查看数据,并进行 2D 和 3D 测量。

现在,让我们使用数字光学显微镜拍摄图像。首先,打开显微镜并打开成像软件。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。当成像软件打开时,从模板列表中选择作业或选择免费考试。然后,获取显示整个阶段的概述图像。使用控制器更改焦点和图像位置。

采集完成后,在图像上放置坐标系。默认坐标系位于舞台中间。为了更灵活,可以手动更改坐标。

然后命名示例并选择相机按钮。在导航示例时,按下实时按钮并向下移动焦点,直到示例清晰聚焦。如果需要,请使用照明和光圈选项卡来调整照明。然后获取示例的图像。

使用图像优化面板下的工具,例如镜头的倾斜度、样品上的照明级别以及图像中的亮度和对比度,以优化图像以达到所需的清晰度。现在,点击铅笔工具执行测量。使用距离和面积工具测量样本上的单元格大小。

最后,转到结果工作流选项卡并配置报表的布局。点击保存按钮以保存作业以供进一步分析。

现在,让我们分析使用共聚焦和数字光学显微镜拍摄的小鼠大脑的图像。50 倍放大的共聚焦图像具有高分辨率,可提供深度对焦,提供不同深度的信息。

在地形图上,该样本的高点范围为 1 到 9 微米。可以进一步分析振幅、粗糙度曲线和曲线参数等特征。然而,切片脑组织的整个幻灯片可以使用数字光学显微镜进行成像。

放大部分可显示样品的更多详细信息,但分辨率远低于共聚焦显微镜。该样本以300倍放大倍率获得。专用软件提供用于测量横截面尺寸(如直径)以及计算截面内部面积的工具。

数字、光学和共聚焦显微镜是各种生物医学应用的标准工具。扫描激光眼科或SLO是一种非侵入性成像技术,广泛用于临床眼科诊断和监测视网膜疾病的发展。

SLO 生成高对比度立体图像,使微胶质可视化。视网膜的常驻巨噬细胞,涉及多种视网膜疾病。共聚焦显微镜也用于活细胞成像,使研究人员能够实时可视化显微生物细胞功能。

该技术用于研究细胞迁移和增殖以及蛋白质动力学等。在这里,跨膜受体和地合体被标记与荧光染料,并分析其共定位使用延时成像研究受体内化。

您刚刚观看了 JoVE 对数字、光学和共聚焦显微镜的介绍。现在,您应该了解显微镜和图像分辨率的原理,如何操作光学和共聚焦显微镜来成像生物样品,以及它们在生物医学工程领域的几个应用。

谢谢你的收看。

Results

下图概述了使用共聚焦显微镜小鼠大脑可获得的结果。它们显示了如何获得不同级别的信息,以及结果的地形图如何显示样本的高度。

Figure 5
5:50倍放大倍率的共聚焦图像,显示被分割的小鼠大脑。左侧的图像是一个复合图像,可在断层扫描过程中拍摄所有对焦平面,并创建一个高分辨率和深度聚焦的图像。右侧的图像显示示例的地形图。

Figure 6
6:作为共聚焦显微镜3D应用的一个比较具有代表性的例子,对塑料孔进行了成像和分析。原始地形图位于左侧,3D 重建位于右侧。

Figure 7
图 7: 显示了 ConfoMap 软件分析的范围,用于从 3D 重建中观察配置文件。显示了振幅参数、粗糙度轮廓、曲线表征。

下图概述了在同一小鼠大脑切片上使用数字光学显微镜可以获得的结果。数字显微镜提供更大的视野,但分辨率较低的图像从共聚焦显微镜,这是理想的看较大的成分或生物结构。该软件具有测量样品的有用分析工具。

Figure 8
8:显示整个器官切片的概述图像。

Figure 9
9:缩小被分割的鼠标大脑的图像。这里有一个300微米的视野,通过混合同轴和环形照明以及电子图像稳定获得。

Figure 10
图10:演示数字光学显微镜的测量能力。样品的直径在左侧测量,右侧显示用于计算切片小鼠大脑内部面积的用户定义的轮廓。这些工具在分析生物样本时非常有用,生物样本的边可能与预定义的形状不同。

Applications and Summary

在本演示中,优化了光学和共聚焦显微镜的对焦深度、视野以及最大分辨率和放大倍率,以观察生物样品。本演示旨在帮助学员决定哪种显微镜模块最适合特定应用。这两种显微镜模式在分析生物样品时具有优点,易于制备和高分辨率复合图像。

光学和共聚焦显微镜的应用意义深远。由于样品制备有限,集成运动平面和使用超采样光技术的能力,这些工具能够从大多数数据集获取信息。显微镜在成像活细胞(如用荧光处理的细胞)时一直很受欢迎,但应用范围从生物医学设备的成像表面到在植入体内之前检测缺陷和粗糙度。共聚焦和光学显微镜是成像生物样品的现行标准。

最后,共聚焦显微镜通过荧光技术提供了改进的成像技术。样品中的荧光团的寿命有限,在暴露于高光照下时,可以进行光漂白。在传统的光显微镜中,整个样品在成像过程中被照亮,从而快速进行光漂白。然而,由于只有一小部分样品同时通过共聚焦显微镜进行照明,因此荧光团的寿命更长,与光漂白相关的挑战也较少。

1. 共聚焦成像

  1. 将样品加载到舞台上。将其居于镜头下方。它不应超过阶段的重量限制,在这种情况下为 5 kg。样品厚度不应超过 100 mm。
  2. 打开成像软件并选择"创建作业"。
  3. "地形列"下,选择"辅助"按钮。
  4. 以最低放大倍数 2.5 倍创建概览图像。在切换放大倍率之前,通过更改 Z 位置确保样本处于焦点,直到看到清晰的图像。这可以通过向下推或拉起 3D 显微镜操纵器来实现。通过接合侧面的按钮,可以实现更精细的 Z 运动,从而在边缘周围产生蓝光。
  5. 慢慢增加镜头放大倍率,持续播放光强和对焦,直到达到所需的放大倍数。如果需要,使用操纵器在 x 和 y 方向移动舞台,选择其他感兴趣区域。
  6. 以低倍率拍摄概览图像后,按下一个按钮继续参考点步骤。如果需要,请指定某个参考点进行测量(即样品的角),但为此而言,默认参考点可以。
  7. 点击下一个箭头以继续向导的下一部分。
  8. 根据需要更改目标以查看适合您的样本的分辨率。在这种情况下,50X 物镜用于可视化样品中的细胞。50X 是最接近样品的镜头,因此逐渐移动到 50X 目标,确保 20X 镜头后仍有空间缩短工作距离。
  9. 在"测量范围定义"页上,稍微移动 Z 位置(单击操纵器上的侧边按钮进行微调),以便只有样本顶部处于焦点位置,然后单击"设置最后一个"。然后按 Z 方向(向下)移动舞台,直到只有样本的最底部处于焦点,然后按"先设置"。确保计算切片数不超过 1000,否则程序将失败。
  10. 确保光线强度不会在任何级别的图像中过度饱和(导致红色像素),然后点击完成。这将拍摄断层扫描图像并打开断层扫描软件。
  11. 在断层扫描软件中,打开"研究"选项卡等选项卡,以 3D 格式查看数据并在 2D 或 3D 空间中进行测量。

2. 数字光学显微镜成像

  1. 将样品加载到舞台上。将样品居中到镜头下方。样品重量不应超过阶段的重量限制,在这种情况下为 4 kg。样品不应高于 12 厘米。
  2. 打开成像软件。
  3. 从提供的模板列表中选择作业。也可以通过按免费考试在工作之外工作,这样您可以研究工作以外的样本。
  4. 获取显示整个阶段的概览图像。这将作为稍后的地图,以显示正在查看的示例部分。获取图像时,使用控制器更改焦点和图像位置。
  5. 放置坐标系。默认坐标系来自舞台的左后角,适合此应用程序。如果样本弯曲,您可以在此处调整坐标。
  6. 命名示例和作业,这会将其添加到作业列表中,以便其他用户可以返回到该列表。
  7. "获取"下选择"相机"按钮。拍摄初始图像,然后在导航示例时按实时按钮。
  8. 向下移动焦点,直到样本明显聚焦。可能还需要在"照明和光圈"选项卡下调整照明。
  9. 使用"图像优化"面板下的工具优化图像。您可以在"图像增强"选项卡下玩不同的参数,例如镜头的倾斜度、样品上的照明级别以及亮度和对比度,直到图像达到所需的清晰度。
  10. 通过点击软件上的铅笔工具执行测量。从那里,您可以访问多个测量工具,包括距离、角度和面积。使用距离和面积工具测量样本的大小。
  11. 转到"结果工作流"选项卡并检查工作流布局以配置报表的布局
  12. 点击"保存"按钮以保存作业,以便其他人可以使用相同的工作流。

显微镜是一种广泛用于成像样品详细结构的方法。光学显微镜通过一系列透镜聚焦光线以放大样品,在17世纪出现了第一台复合显微镜,已经使用了几个世纪。在此期间,Antonie van Leeuwenhoek 是第一个观察细菌、酵母、红血球和毛细血管循环的人,为微观发展做出了重大科学贡献。

光学显微镜至今仍广泛用于医学诊断的研究和临床设置。然而,在过去 60 年中,出现了共聚焦显微镜,通过针孔照亮样品,以提高光学分辨率和对比度。

本视频将说明光学和共聚焦显微镜的操作原理,展示如何分析高分辨率图像,并探讨显微镜在生物医学工程领域的几个应用。

让我们首先讨论共聚焦显微镜的基本原理。光学显微镜基于将光聚焦到样品上以成像其详细结构的原理。显微镜由两个放大元件组成;物镜,聚焦物体的真实图像,目镜,在眼睛接收之前聚焦放大的虚拟图像。总放大倍数是通过将这两个镜头的放大倍数乘以来实现的。

光的对焦为放大倍数和灯灯都在同一点相遇,从而给出指定的对焦平面,从而在图像中给出最佳分辨率。当在焦平面外部时,照明区域较大,光束会干扰样本的其他部分,导致图像模糊。当光学显微镜照亮并成像整个样品时,共聚焦显微镜利用样品级和探测器之间的针孔,以便一次只聚焦一个小光束。

因此,样本的唯一可见区域是焦点,提供解析良好的图像。但是,如果分辨率较高,则一次只能对此示例的一小部分进行成像。通过在 X-Y 平面中移动样品,可以对其表面进行栅格扫描。对于扫描的每个点,通过调整 Z 高度来访问不同的焦平面来优化焦点。这可确保图像样本的逐点分辨率最大化。

现在,让我们使用显微镜和图像分辨率的这些原则,使用共聚焦和光学显微镜对小鼠大脑进行成像。

在回顾了显微镜的主要原理后,现在让我们使用共聚焦显微镜进行测量。首先,打开计算机工作站的显微镜。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。现在打开映像软件并选择创建新作业。转到地形的列并选择辅助按钮。选择此显微镜的最低放大倍数为 2.5 倍。然后使用 3D 显微镜操纵器调整样品的 Z 位置,使样品聚焦。按下侧面的按钮,使边缘周围出现蓝光。这允许更精细的 Z 运动和对焦。现在捕获概览图像。

缓慢增加镜头放大倍率并调整光强和对焦以获得所需的放大倍率。使用 X 和 Y 方向中的 3D 操纵器在样品上选择不同感兴趣的区域。以低放大倍率拍摄图像后,按旁边取参考点。使用默认参考点,或在示例角指定新参考点,然后按下一步。现在逐渐将目标更改为样本所需的分辨率。对于这个样本,20x目标用于可视化小鼠脑组织中的细胞。确保有空间缩短工作距离。

要定义收集切片的距离,请先转到测量范围定义页,并使用 3D 操纵器最终调整 Z 方向的样本。当示例顶部处于焦点时,单击"上次设置";当示例底部处于焦点时,首先单击"设置"。确保计算切片数不超过 1,000 或程序将失败。验证没有红色像素,这表示光的强度过饱和。

最后,按完取断层扫描图像。打开断层扫描软件时,选择"算例"选项卡以 3D 格式查看数据,并进行 2D 和 3D 测量。

现在,让我们使用数字光学显微镜拍摄图像。首先,打开显微镜并打开成像软件。然后将样品加载到舞台上,并将其居于镜头下方。当成像软件打开时,从模板列表中选择作业或选择免费考试。然后,获取显示整个阶段的概述图像。使用控制器更改焦点和图像位置。

采集完成后,在图像上放置坐标系。默认坐标系位于舞台中间。为了更灵活,可以手动更改坐标。

然后命名示例并选择相机按钮。在导航示例时,按下实时按钮并向下移动焦点,直到示例清晰聚焦。如果需要,请使用照明和光圈选项卡来调整照明。然后获取示例的图像。

使用图像优化面板下的工具,例如镜头的倾斜度、样品上的照明级别以及图像中的亮度和对比度,以优化图像以达到所需的清晰度。现在,点击铅笔工具执行测量。使用距离和面积工具测量样本上的单元格大小。

最后,转到结果工作流选项卡并配置报表的布局。点击保存按钮以保存作业以供进一步分析。

现在,让我们分析使用共聚焦和数字光学显微镜拍摄的小鼠大脑的图像。50 倍放大的共聚焦图像具有高分辨率,可提供深度对焦,提供不同深度的信息。

在地形图上,该样本的高点范围为 1 到 9 微米。可以进一步分析振幅、粗糙度曲线和曲线参数等特征。然而,切片脑组织的整个幻灯片可以使用数字光学显微镜进行成像。

放大部分可显示样品的更多详细信息,但分辨率远低于共聚焦显微镜。该样本以300倍放大倍率获得。专用软件提供用于测量横截面尺寸(如直径)以及计算截面内部面积的工具。

数字、光学和共聚焦显微镜是各种生物医学应用的标准工具。扫描激光眼科或SLO是一种非侵入性成像技术,广泛用于临床眼科诊断和监测视网膜疾病的发展。

SLO 生成高对比度立体图像,使微胶质可视化。视网膜的常驻巨噬细胞,涉及多种视网膜疾病。共聚焦显微镜也用于活细胞成像,使研究人员能够实时可视化显微生物细胞功能。

该技术用于研究细胞迁移和增殖以及蛋白质动力学等。在这里,跨膜受体和地合体被标记与荧光染料,并分析其共定位使用延时成像研究受体内化。

您刚刚观看了 JoVE 对数字、光学和共聚焦显微镜的介绍。现在,您应该了解显微镜和图像分辨率的原理,如何操作光学和共聚焦显微镜来成像生物样品,以及它们在生物医学工程领域的几个应用。

谢谢你的收看。

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

RECOMMEND JoVE