Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie

Immunology

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Concepts

Quelle: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Abteilung für Lymphpoiesis, Institut für Immunologie, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
2 INSERM U1223, Paris, Frankreich
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, Frankreich
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, Frankreich

Der Zellzyklus ist ein universeller Prozess des Lebens. Während des Zellzyklus erfährt eine Zelle mehrere Modifikationen, um sich in zwei Tochterzellen zu teilen. Dieser Mechanismus tritt im gesamten Leben eines Organismus als Reaktion auf seine Bedürfnisse auf. Zellteilungen und embryonale Entwicklung produzieren einen vollständigen Organismus aus einer einzelligen Zygote. Im Erwachsenenalter ist der Zellzyklus für viele kritische biologische Prozesse, wie Gewebereparaturen, von zentraler Bedeutung.

Mechanismen der Zellteilung sind streng kontrollierte Ereignisse, bei denen die Zelle vor der endgültigen Teilung schrittweise modifikationen. Zellen, die sich noch nicht im Zyklus befinden,werden als in der Phase "Lücke 0". In dieser Phase gilt die Zelle als ruhend. Wenn die Zelle zu zyklieren beginnt, werden vier verschiedene Phasen erkannt: Lücke 1 (G1), Synthese (S), Lücke 2 (G2) und Mitosis (M). G1 Phase ist ein Checkpoint für Ressourcen, die von der Zelle für die DNA-Synthese benötigt werden. Dann tritt die S-Phase auf, und die DNA-Replikation beginnt, gefolgt von der G 2-Interphase, einem weiteren Prüfpunkt, der alle Elemente steuert, die erforderlich sind, damit die Zelle geteilt werden kann. Schließlich tritt die Zelle in die Mitose ein und teilt sich in zwei Tochterzellen.

Die Zellteilung ist ein sehr informativer Parameter in vielen verschiedenen biologischen Systemen. Im Bereich der Immunologie kann die Analyse der Leukozytenproliferation auf den Mechanismus der Immunantwort hinweisen. Andere Untersuchungsbereiche stützen sich ebenfalls auf die Zellzyklusanalyse. Zum Beispiel hat die Analyse des Zellzyklus während der Tumorentwicklung unser Verständnis von Krebs verbessert.

Viele Fluoreszenzfarbstoffe sind jetzt für die Verfolgung der Zellproliferation verfügbar. Diese Farbstoffe unterscheiden sich in ihren chemischen und spektralen Eigenschaften. Es gibt zwei verschiedene Klassen von Farbstoffen: Proteinfarbstoffe verbinden sich dauerhaft mit Protein, indem sie eine kovalente Bindung bilden, und Membranfarbstoffe, die über starke hydrophobe Assoziationen stabil in Zellmembranen intercalate. In-vitro- und In-vivo-Studien zur Proliferation von Immunzellen durch Durchflusszytometrie gehören zu den häufigsten Anwendungen beider Klassen von Zelltracking-Farbstoffen (1, 2).

CFSE (Carboxyfluorescein succinimidylester) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der teilende Zellen markiert. Zunächst erhalten alle Zellen die gleiche Menge an Farbstoff; Die teilenden Zellen teilen den Farbstoff, den sie erhielten, gleichmäßig zwischen ihren beiden Tochterzellen auf. Folglich kann dem Zellzyklus die fortschreitende Abnahme der Farbstoffintensität in den Zellen folgen. Auf cfSE-Färbung folgt die herkömmliche multiparametrische Durchflusszytometrie, eine technologiebasierter Technologie mit hohem Durchsatz, die eine phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Zellen auf der Grundlage ihres CFSE-Färbegrades ermöglicht (3).

Im folgenden Experiment bewerten wir die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen in-vitronach CD3-Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Immunologie. Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Vorbereitung

  1. Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
  2. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann gründlich trocken.
  3. Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

  1. Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
  2. Mit Zange, bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und Milz auszusetzen. Die Milz ist am Magen befestigt.
  3. Mit Zangen die Milz vorsichtig vom Magen lösen und in die Petrischale legen, die 5 ml HBSS 2% FCS enthält.

3. Immunzellisolierung

  1. Legen Sie die Milz auf ein 40 m Zellsieb über die gleiche Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es zu dissoziieren.
  2. Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
  3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
  4. Das Pellet in 2 ml Kaliumacetat wieder aufsetzen, um die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie 2 min und machen Sie dann das Volumen bis zu 15 ml mit HBSS 2% FCS.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder aus.
  6. Zählen Sie die Zellen mit einem Trypan-Blau-Färbe-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 107 Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. CFSE Färbung und T-Zell-Stimulation

  1. 107 isolierte Milzzellen/Rohr in 4 Röhren verteilen (15 ml-Rohre, beschriftet 1 bis 4)
  2. Fügen Sie 3 ml HBSS 2%FCS zu jeder Röhre hinzu.
  3. Fügen Sie in jedem Rohr 1 L CSFE hinzu (Endkonzentration - 5 m).
  4. Inkubieren Sie die Rohre bei 37°C in einem 5%CO2-Inkubator für 10 min.
  5. In den Röhren 3 und 4 12 ml HBSS 2% FCS + Anti-CD3-Antikörper mit einer Endkonzentration von 2,5 g/ml hinzufügen. Die Tuben 3 und 4 werden mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert, um die Wirkung auf den Zellzyklus zu beobachten.
  6. In den Rohren 1 und 2 12 ml HBSS 2% FCS hinzufügen. Die Zellen in den Röhren 1 und 2 werden nicht stimuliert.
  7. Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie die Überräube.
  8. Setzen Sie die Pellets in 2 ml HBSS 2%FCS wieder aus.
  9. Übertragen Sie die resultierenden Lösungen in separate Brunnen auf einer 6-Well-Platte.
  10. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C, 5%CO2 für 3 Tage.

5. Zellfärbung

  1. Fügen Sie am 3. Tag 2 mL HBSS 2%FCS in gut 1 und 3 hinzu.
  2. Pipetten Sie kräftig und übertragen Sie die Proben in 5 ml FACS-Rohre.
  3. Die verbleibenden Zellen aus den Brunnen 2-4 bei 37°C, 5%CO2weiter inkubieren. Sie werden am 5. Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie die Überräube.
  5. Fügen Sie jedem Rohr 100 L Antikörpermischung (siehe Tabelle 1) hinzu.
antikörper Fluorochrom verdünnung
CD3 Pacific Blue 1/100
CD4 BV786 1/1600
CD8 Pe 1/400
Thy1.2 BV605 1/400

Tabelle 1: Antikörper-Mix-Zusammensetzung. Vier Antikörper-Cocktail-Präparate mit konzentrierten Antikörper-fluoreszierenden Konjugaten und HBSS.

  1. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min auf Eis im Dunkeln.
  2. 1 ml HBSS 2%FCS hinzufügen und die Rohre bei 370 x g zentrieren für 7 min bei 10°C.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 200 l HBSS 2% FCS wieder aus.
  4. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue, markierte FACS-Rohre.
  5. Bewerten Sie die T-Zell-Proliferation mit FACS.
  6. Wiederholen Sie am 5. Tag den Zellfärbungsprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Brunnen der 6-Well-Platte.

6. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die "FlowJo" Software und ziehen Sie die Dateien in das Fenster "Alle Beispiele".
  2. Doppelklicken Sie auf die Datei für nicht stimulierte Zellen, die am 3. Tag gesammelt wurden, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der Y-Achse und Seitenstreuung auf der X-Achse anzuzeigen.
  3. Klicken Sie auf "Polygon" und erstellen Sie eine Gating-Strategie, um Lymphzellen, Thy1.2+ CD3+ Zellen auszuwählen und CD4+ und CD8+ Zellen zu unterscheiden (siehe Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Gating-Strategie. Zellen werden zuerst basierend auf ihrer Morphologie abgegrenzt (links: FSC-A, SSC-A). T-Zellen werden dann abgezäutt (Mitte: CD3, Thy1.2) und weiter auf CD4+ T-Zellen (orange) und CD8+ T-Zellen (blau) (rechts: CD4, CD8) aufgeteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Wiederholen Sie die Schritte mit anderen Dateien.
  2. Um die Häufigkeiten von teilenden und nicht dividierenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zuerst die Zellpopulationen, indem Sie auf"Layout-Editor"klicken.
  3. Ziehen Sie die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen von jeder der vier Röhren in das "Alle Beispielfenster"
  4. Diagramme, die jede Grundgesamtheit darstellen, werden angezeigt.
  5. Verwenden Sie Histogramm, um die Ergebnisse zu visualisieren und wählen Sie "CFSE" als Parameter für den Vergleich der verschiedenen Röhren und der verschiedenen Populationen.
  6. Nicht trennende Zellen halten ein höheres CFSE-Niveau aufrecht, während sich vermehrende Zellen den Gehalt von CFSE auf teilende Zellen verteilen.
  7. Erstellen Sie ein Tor auf nicht teilenden Zellen und wenden Sie es in allen Rohren an.
  8. Erstellen Sie ein Tor auf teilenden Zellen und wenden Sie es in allen Rohren an.
  9. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3+-Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf"Tabelleneditor".
  10. Ziehen Sie die Voninteresseen - CD8-T-Zellen und CD4-T-Zellen - in"Tabelle".
  11. Wählen Sie im Menü"Statistik""Frequenz der T-Zellen"aus, und klicken Sie dann auf"Tabelle erstellen",um die Frequenz in einer neuen Tabelle anzuzeigen.
  12. Klicken Sie auf"Tabelle erstellen". Um die Frequenzwerte anzuzeigen, wird in einer neuen Tabelle angezeigt.

Für die meisten immunologischen Studien ist die Messung der Proliferation von Immunzellen ein wichtiger Schritt und die CFSE-Fluoreszenzfarbstoff-basierte Methode wird häufig verwendet. Die richtige Zellteilung ist wichtig für Immunzellen, da sie sowohl das Niveau als auch die Spezifität einer Immunantwort reguliert. Beispielsweise vermehren sich T-Zellen, um Krebszellen zu identifizieren und abzutöten, und B-Zellen durchlaufen eine Zellteilung, um spezifische Antikörper zu produzieren. Die allgemeine Prämisse des CSFE-Assays besteht darin, die Zellen mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff CFSE zu färben, der in lebende Zellen eindringt und stabil an die Proteine im Inneren bindet, was zu einer dauerhaften Kennzeichnung führt. Wenn sich die farbstoffhaltige Elternzelle teilt, erhält jede Tochterzelle die Hälfte der Fluoreszenz von der übergeordneten Zelle.

Dieser Prozess setzt sich in den nachfolgenden Divisionen fort, wobei die Farbintensität mit jeder Division allmählich abnimmt. Am gewünschten Endpunkt wird die Fluoreszenzintensität jeder Zelle durch Durchflusszytometrie gemessen. Diese Daten werden dann verwendet, um die Anzahl und das Muster der Divisionen zu quantifizieren, die die Zellen durchlaufen haben. Wie hier gezeigt, stammt die Zellpopulation mit der höchsten Fluoreszenz aus der Elterngeneration. Die zweithöchste gehört der zweiten Generation und so weiter. Die Anzahl der Spitzen bestimmt die Anzahl der Zellteilungen.

Darüber hinaus können bei verwendung sirdischer Immunzellen bestimmte Zellpopulationen, wie z.B. die T-Zellen, zusammen mit CFSE mit einem verschiedenfarbigen Fluoreszenzfarbstoff beschriftet und gleichzeitig mit mehrfarbiger Durchflusszytometrie identifiziert werden. Die neuen Daten können auf demselben Diagramm dargestellt werden, das nun die T-Zell-Unterpopulation mit unterschiedlichen CFSE-Färbungsintensitäten zeigt, mit denen die Proliferationsrate der T-Zellen gezielt analysiert werden kann. Dieses Video zeigt das Protokoll zur CFSE-Färbung von Maussplenozyten, die mit einem Anti-CD3-Antikörper stimuliert werden. Es folgt eine Färbung, um T-Zellen zu beschriften und zytometrie zu durchflussen, um ihre Zellproliferation zu verfolgen.

Zunächst geeignete Schutzkleidung und Laborhandschuhe anziehen. Als nächstes waschen Sie ein Paar Zangen und sezieren Schere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch trocken. Bereiten Sie 50 Milliliter von Hanks Balanced Salt Solution, oder HBSS, mit einer Konzentration von 2% fetalem Kalbsserum, oder FCS, vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einer 50-Milliliter-Röhre kombinieren. Mischen Sie die Lösung etwa 10 Mal, indem Sie die Lösung sanft nach oben und unten pfeifen. Dann isolieren Sie Mausmilzzellen, wie im Videoprotokoll zur FACS-Isolierung von Milz-B-Lymphozyten gezeigt.

Etikettieren Sie vier 15-Milliliter-Röhren eins bis vier und fügen Sie ein mal 10 zu den siebten isolierten Milzzellen hinzu. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS zu jeder Röhre hinzu. Dann pipette einen Mikroliter von fünf mikromolaren Carboxyfluorescein succinimidyl ester, oder CFSE, in jedes Rohr. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 10 Minuten. Die Zellen in den Röhren eins und zwei werden nicht stimuliert. Sie werden verwendet, um den Basalgehalt der Proliferation von Milz-CD4- und CD8-T-Zellen zu enthüllen.

Pipette 10 Milliliter HBSS 2% FCS in diese Rohre. Die Röhren drei und vier werden durch Anti-CD3-Antikörper stimuliert, um die Auswirkungen auf den Zellzyklus zu beobachten. Fügen Sie 10 Milliliter HBSS 2% FCS und Anti-CD3-Antikörper mit einer Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu den Tuben drei und vier hinzu. Als nächstes zentrieren Sie alle Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Setzen Sie die Pellets in zwei Milliliter HBSS 2% FCS wieder auf und pipette die resultierenden Lösungen in separate Bohrungen auf einer Sechs-Brunnen-Platte. Beschriften Sie die Platte sorgfältig von eins bis vier, um die Probenidentitäten nachzuverfolgen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für drei Tage.

Am dritten Tag zwei Milliliter HBSS 2% FCS zu den Brunnen eins und drei hinzufügen, die die Zellen aus den Röhren eins und drei enthalten sollten. Rohrleitung kräftig nach oben und unten und dann die Proben in beschriftete Fünf-Milliliter-FACS-Rohre übertragen. Legen Sie die Sechs-Well-Platte wieder in den Inkubator. Diese verbleibenden Zellen aus den Brunnen zwei und vier werden am fünften Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube. Fügen Sie nun 100 Mikroliter Antikörper-Mix zu jedem Rohr hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter HBSS 2% FCS zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Die Pellets in 200 Milliliter HBSS 2% FCS wieder aufhängen und gut mischen. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue markierte FACS-Rohre.

Bewerten Sie dann die T-Zell-Proliferation mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt. Gate die Zellen, um lymphoide CD3-positive Zellen auszuwählen und CD4-positive und CD8-positive Zellen zu unterscheiden, und die Daten für Röhren eins und drei aufzeichnen. Wiederholen Sie am fünften Tag den Zellfärbungsprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte.

Wir analysieren die Auswirkungen der CD3-Stimulation auf den Zellzyklus von CD4- und CD8-positiven Zellen an drei Tagen und fünf Tagen nach der Stimulation. Um zu beginnen, klicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie Ihre Dateien in das Fenster Alle Beispiele. Doppelklicken Sie auf die Datei für die am dritten Tag gesammelten nicht stimulierten Zellen, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der y-Achse und Seitenstreuung auf der x-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen basierend auf ihrer Morphologie zu umkreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation die Lymphozyten der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit und wählen Sie im neuen Fenster Thy1.2 auf der y-Achse und CD3 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD3- und Thy1.2-Doppel-Positivzellen zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit die T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Als Nächstes doppelklicken Sie auf die eingekreiste Bevölkerung. Wählen Sie im neuen Fenster CD4 auf der y-Achse und CD8 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD4-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD4 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie nun auf Polygon, um die CD8-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD8 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diese Schritte mit den anderen Dateien.

Um die Häufigkeiten von teilenden und nicht dividierenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zunächst die Zellpopulationen, indem Sie auf Layout-Editor klicken. Ziehen Sie dann die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen von jedem der vier Röhren in das Fenster Alle Samples. Diagramme, die Ihre Populationen darstellen, werden angezeigt. Doppelklicken Sie für jede Röhre auf das Punktdiagramm für CD8-T-Zellen, und wählen Sie Histogramm unter Graphendefinition aus, um die Ergebnisse zu visualisieren. Wählen Sie CFSE als Parameter aus, um die stimulierten und nicht stimulierten Zellpopulationen zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Nicht trennende Zellen halten höhere CFSE-Spiegel bei, während sich vermehrende Zellen den Gehalt von CFSE in teilende Zellen aufteilen.

Wenn Sie nun die Umschalttaste drücken, doppelklicken Sie auf das Histogramm. Klicken Sie im neuen Fenster auf den Bereich, und wählen Sie den CFSE-Bereich aus, der dem höchsten Peak entspricht. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundbevölkerung die Grundgesamtheit Nicht dividierende CD8-T-Zellen, und beschriften Sie die Grundgesamtheit, die CD8-Zellen teilt. Wiederholen Sie dies, um die teilenden und nicht teilenden CD4-T-Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3-positiven Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf Tabelleneditor. Ziehen Sie dann die von Interesse interessierten Populationen, teilen Sie CD8 T-Zellen und Teilen von CD4 T-Zellen, in die Tabelle. Wählen Sie im Menü Statistik die Option Frequenz der T-Zellen aus. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen, um die Häufigkeit in einer neuen Tabelle anzuzeigen.

Results

In diesem Experiment verfolgten wir die Proliferation von Splenic CD4+ und CD8+ T-Zellen in der In-vitro-Kultur. Nach 3 Tagen haben wir keine starke Proliferation sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T-Zellen mit oder ohne Stimulation gesehen. Dies ist auf dem oberen Panel von Abbildung 2 zu sehen, wo die Spitzen von CSFE nicht abnehmen. Nach 5 Tagen begannen wir jedoch, eine Proliferation in beiden Populationen zu beobachten, was sich am Rückgang der CSFE-Spitzen zeigt (untere Panels, Abbildung 2). CFSE-Färbung zeigt deutlich, dass sich sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen nach der Stimulation mehr teilten. Darüber hinaus schienen CD8+ T-Zellen nach 5 Tagen Stimulation etwas proliferativer zu sein als CD4+ T-Zellen.

Figure 2
Abbildung 2: CD4 versus CD8 T-Zellen Proliferation. Proliferation von T-Zellen an Tag 3 (obere Platte) und Tag 5 (untere Platte). Der Zellzyklus wird zwischen CD4- und CD8-T-Zellen mit oder ohne Stimulation an zwei verschiedenen Tagen verglichen. CD4- und CD8-T-Zellen vermehren sich stärker, wenn sie stimuliert werden. CD8 stimulierte T-Zellen vermehren sich an Tag 5 mehr als CD4 stimulierte T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Applications and Summary

Proliferations-Assays werden häufig in verschiedenen Bereichen wie der Immunologie verwendet, um den Grad der Aktivierung von Zellen zu bestimmen. Es wird auch in der onkologischen Diagnostik durchgeführt, um Die Tumoraggressivität bei Patienten zu bestimmen. CFSE-Färbung ist eine nützliche Technik, um die Proliferation von Immunzellpopulationen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Andere Methoden ermöglichen die Charakterisierung des Zellzyklus. BrdU, ein Äquivalent von CFSE, wird nur in teilenden Zellen eingebaut. Jüngstes Fucci-Mausmodell ermöglicht sogar die Erkennung von Zellzyklusphasen ohne zusätzliche Färbung.

References

  1. Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
  2. Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
  3. Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).

1. Vorbereitung

  1. Vor Beginn Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzkleidung anziehen.
  2. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge, zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann gründlich trocken.
  3. Bereiten Sie 50 ml von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) vor, die 2% fetales Kalbsserum (FCS) enthält.

2. Dissektion

  1. Mit einem Kohlendioxid-Zufuhrsystem, euthanisieren Sie die Maus durch Hypoxie. Sichern Sie die eingeschläferte Maus auf einer Sezierplatte in der Supine-Position und führen Sie eine Längs-Laparotomie mit Schere und Zange durch.
  2. Mit Zange, bewegen Sie den Darm und Magen auf der rechten Seite des Bauches, um den Magen und Milz auszusetzen. Die Milz ist am Magen befestigt.
  3. Mit Zangen die Milz vorsichtig vom Magen lösen und in die Petrischale legen, die 5 ml HBSS 2% FCS enthält.

3. Immunzellisolierung

  1. Legen Sie die Milz auf ein 40 m Zellsieb über die gleiche Petrischale. Crush die Milz mit einem Kolben, um es zu dissoziieren.
  2. Übertragen Sie die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit in ein 15 ml Zentrifugenrohr.
  3. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 370 x g für 7 min bei 10°C und entsorgen Sie den Überstand, um das Pellet zu vermeiden.
  4. Das Pellet in 2 ml Kaliumacetat wieder aufsetzen, um die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie 2 min und machen Sie dann das Volumen bis zu 15 ml mit HBSS 2% FCS.
  5. Zentrifugieren Sie das Rohr wieder bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml HBSS 2% FCS wieder aus.
  6. Zählen Sie die Zellen mit einem Trypan-Blau-Färbe-Assay und passen Sie die endgültige Zellkonzentration auf 107 Zellen/ml mit einem entsprechenden Volumen von HBSS 2% FCS an.

4. CFSE Färbung und T-Zell-Stimulation

  1. 107 isolierte Milzzellen/Rohr in 4 Röhren verteilen (15 ml-Rohre, beschriftet 1 bis 4)
  2. Fügen Sie 3 ml HBSS 2%FCS zu jeder Röhre hinzu.
  3. Fügen Sie in jedem Rohr 1 L CSFE hinzu (Endkonzentration - 5 m).
  4. Inkubieren Sie die Rohre bei 37°C in einem 5%CO2-Inkubator für 10 min.
  5. In den Röhren 3 und 4 12 ml HBSS 2% FCS + Anti-CD3-Antikörper mit einer Endkonzentration von 2,5 g/ml hinzufügen. Die Tuben 3 und 4 werden mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert, um die Wirkung auf den Zellzyklus zu beobachten.
  6. In den Rohren 1 und 2 12 ml HBSS 2% FCS hinzufügen. Die Zellen in den Röhren 1 und 2 werden nicht stimuliert.
  7. Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie die Überräube.
  8. Setzen Sie die Pellets in 2 ml HBSS 2%FCS wieder aus.
  9. Übertragen Sie die resultierenden Lösungen in separate Brunnen auf einer 6-Well-Platte.
  10. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C, 5%CO2 für 3 Tage.

5. Zellfärbung

  1. Fügen Sie am 3. Tag 2 mL HBSS 2%FCS in gut 1 und 3 hinzu.
  2. Pipetten Sie kräftig und übertragen Sie die Proben in 5 ml FACS-Rohre.
  3. Die verbleibenden Zellen aus den Brunnen 2-4 bei 37°C, 5%CO2weiter inkubieren. Sie werden am 5. Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für 7 min bei 10°C. Entsorgen Sie die Überräube.
  5. Fügen Sie jedem Rohr 100 L Antikörpermischung (siehe Tabelle 1) hinzu.
antikörper Fluorochrom verdünnung
CD3 Pacific Blue 1/100
CD4 BV786 1/1600
CD8 Pe 1/400
Thy1.2 BV605 1/400

Tabelle 1: Antikörper-Mix-Zusammensetzung. Vier Antikörper-Cocktail-Präparate mit konzentrierten Antikörper-fluoreszierenden Konjugaten und HBSS.

  1. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min auf Eis im Dunkeln.
  2. 1 ml HBSS 2%FCS hinzufügen und die Rohre bei 370 x g zentrieren für 7 min bei 10°C.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 200 l HBSS 2% FCS wieder aus.
  4. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue, markierte FACS-Rohre.
  5. Bewerten Sie die T-Zell-Proliferation mit FACS.
  6. Wiederholen Sie am 5. Tag den Zellfärbungsprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Brunnen der 6-Well-Platte.

6. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die "FlowJo" Software und ziehen Sie die Dateien in das Fenster "Alle Beispiele".
  2. Doppelklicken Sie auf die Datei für nicht stimulierte Zellen, die am 3. Tag gesammelt wurden, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der Y-Achse und Seitenstreuung auf der X-Achse anzuzeigen.
  3. Klicken Sie auf "Polygon" und erstellen Sie eine Gating-Strategie, um Lymphzellen, Thy1.2+ CD3+ Zellen auszuwählen und CD4+ und CD8+ Zellen zu unterscheiden (siehe Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Gating-Strategie. Zellen werden zuerst basierend auf ihrer Morphologie abgegrenzt (links: FSC-A, SSC-A). T-Zellen werden dann abgezäutt (Mitte: CD3, Thy1.2) und weiter auf CD4+ T-Zellen (orange) und CD8+ T-Zellen (blau) (rechts: CD4, CD8) aufgeteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Wiederholen Sie die Schritte mit anderen Dateien.
  2. Um die Häufigkeiten von teilenden und nicht dividierenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zuerst die Zellpopulationen, indem Sie auf"Layout-Editor"klicken.
  3. Ziehen Sie die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen von jeder der vier Röhren in das "Alle Beispielfenster"
  4. Diagramme, die jede Grundgesamtheit darstellen, werden angezeigt.
  5. Verwenden Sie Histogramm, um die Ergebnisse zu visualisieren und wählen Sie "CFSE" als Parameter für den Vergleich der verschiedenen Röhren und der verschiedenen Populationen.
  6. Nicht trennende Zellen halten ein höheres CFSE-Niveau aufrecht, während sich vermehrende Zellen den Gehalt von CFSE auf teilende Zellen verteilen.
  7. Erstellen Sie ein Tor auf nicht teilenden Zellen und wenden Sie es in allen Rohren an.
  8. Erstellen Sie ein Tor auf teilenden Zellen und wenden Sie es in allen Rohren an.
  9. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3+-Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf"Tabelleneditor".
  10. Ziehen Sie die Voninteresseen - CD8-T-Zellen und CD4-T-Zellen - in"Tabelle".
  11. Wählen Sie im Menü"Statistik""Frequenz der T-Zellen"aus, und klicken Sie dann auf"Tabelle erstellen",um die Frequenz in einer neuen Tabelle anzuzeigen.
  12. Klicken Sie auf"Tabelle erstellen". Um die Frequenzwerte anzuzeigen, wird in einer neuen Tabelle angezeigt.

Für die meisten immunologischen Studien ist die Messung der Proliferation von Immunzellen ein wichtiger Schritt und die CFSE-Fluoreszenzfarbstoff-basierte Methode wird häufig verwendet. Die richtige Zellteilung ist wichtig für Immunzellen, da sie sowohl das Niveau als auch die Spezifität einer Immunantwort reguliert. Beispielsweise vermehren sich T-Zellen, um Krebszellen zu identifizieren und abzutöten, und B-Zellen durchlaufen eine Zellteilung, um spezifische Antikörper zu produzieren. Die allgemeine Prämisse des CSFE-Assays besteht darin, die Zellen mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff CFSE zu färben, der in lebende Zellen eindringt und stabil an die Proteine im Inneren bindet, was zu einer dauerhaften Kennzeichnung führt. Wenn sich die farbstoffhaltige Elternzelle teilt, erhält jede Tochterzelle die Hälfte der Fluoreszenz von der übergeordneten Zelle.

Dieser Prozess setzt sich in den nachfolgenden Divisionen fort, wobei die Farbintensität mit jeder Division allmählich abnimmt. Am gewünschten Endpunkt wird die Fluoreszenzintensität jeder Zelle durch Durchflusszytometrie gemessen. Diese Daten werden dann verwendet, um die Anzahl und das Muster der Divisionen zu quantifizieren, die die Zellen durchlaufen haben. Wie hier gezeigt, stammt die Zellpopulation mit der höchsten Fluoreszenz aus der Elterngeneration. Die zweithöchste gehört der zweiten Generation und so weiter. Die Anzahl der Spitzen bestimmt die Anzahl der Zellteilungen.

Darüber hinaus können bei verwendung sirdischer Immunzellen bestimmte Zellpopulationen, wie z.B. die T-Zellen, zusammen mit CFSE mit einem verschiedenfarbigen Fluoreszenzfarbstoff beschriftet und gleichzeitig mit mehrfarbiger Durchflusszytometrie identifiziert werden. Die neuen Daten können auf demselben Diagramm dargestellt werden, das nun die T-Zell-Unterpopulation mit unterschiedlichen CFSE-Färbungsintensitäten zeigt, mit denen die Proliferationsrate der T-Zellen gezielt analysiert werden kann. Dieses Video zeigt das Protokoll zur CFSE-Färbung von Maussplenozyten, die mit einem Anti-CD3-Antikörper stimuliert werden. Es folgt eine Färbung, um T-Zellen zu beschriften und zytometrie zu durchflussen, um ihre Zellproliferation zu verfolgen.

Zunächst geeignete Schutzkleidung und Laborhandschuhe anziehen. Als nächstes waschen Sie ein Paar Zangen und sezieren Schere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch trocken. Bereiten Sie 50 Milliliter von Hanks Balanced Salt Solution, oder HBSS, mit einer Konzentration von 2% fetalem Kalbsserum, oder FCS, vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einer 50-Milliliter-Röhre kombinieren. Mischen Sie die Lösung etwa 10 Mal, indem Sie die Lösung sanft nach oben und unten pfeifen. Dann isolieren Sie Mausmilzzellen, wie im Videoprotokoll zur FACS-Isolierung von Milz-B-Lymphozyten gezeigt.

Etikettieren Sie vier 15-Milliliter-Röhren eins bis vier und fügen Sie ein mal 10 zu den siebten isolierten Milzzellen hinzu. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS zu jeder Röhre hinzu. Dann pipette einen Mikroliter von fünf mikromolaren Carboxyfluorescein succinimidyl ester, oder CFSE, in jedes Rohr. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 10 Minuten. Die Zellen in den Röhren eins und zwei werden nicht stimuliert. Sie werden verwendet, um den Basalgehalt der Proliferation von Milz-CD4- und CD8-T-Zellen zu enthüllen.

Pipette 10 Milliliter HBSS 2% FCS in diese Rohre. Die Röhren drei und vier werden durch Anti-CD3-Antikörper stimuliert, um die Auswirkungen auf den Zellzyklus zu beobachten. Fügen Sie 10 Milliliter HBSS 2% FCS und Anti-CD3-Antikörper mit einer Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu den Tuben drei und vier hinzu. Als nächstes zentrieren Sie alle Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Setzen Sie die Pellets in zwei Milliliter HBSS 2% FCS wieder auf und pipette die resultierenden Lösungen in separate Bohrungen auf einer Sechs-Brunnen-Platte. Beschriften Sie die Platte sorgfältig von eins bis vier, um die Probenidentitäten nachzuverfolgen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für drei Tage.

Am dritten Tag zwei Milliliter HBSS 2% FCS zu den Brunnen eins und drei hinzufügen, die die Zellen aus den Röhren eins und drei enthalten sollten. Rohrleitung kräftig nach oben und unten und dann die Proben in beschriftete Fünf-Milliliter-FACS-Rohre übertragen. Legen Sie die Sechs-Well-Platte wieder in den Inkubator. Diese verbleibenden Zellen aus den Brunnen zwei und vier werden am fünften Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube. Fügen Sie nun 100 Mikroliter Antikörper-Mix zu jedem Rohr hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter HBSS 2% FCS zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Die Pellets in 200 Milliliter HBSS 2% FCS wieder aufhängen und gut mischen. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue markierte FACS-Rohre.

Bewerten Sie dann die T-Zell-Proliferation mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt. Gate die Zellen, um lymphoide CD3-positive Zellen auszuwählen und CD4-positive und CD8-positive Zellen zu unterscheiden, und die Daten für Röhren eins und drei aufzeichnen. Wiederholen Sie am fünften Tag den Zellfärbungsprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte.

Wir analysieren die Auswirkungen der CD3-Stimulation auf den Zellzyklus von CD4- und CD8-positiven Zellen an drei Tagen und fünf Tagen nach der Stimulation. Um zu beginnen, klicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie Ihre Dateien in das Fenster Alle Beispiele. Doppelklicken Sie auf die Datei für die am dritten Tag gesammelten nicht stimulierten Zellen, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der y-Achse und Seitenstreuung auf der x-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen basierend auf ihrer Morphologie zu umkreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation die Lymphozyten der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit und wählen Sie im neuen Fenster Thy1.2 auf der y-Achse und CD3 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD3- und Thy1.2-Doppel-Positivzellen zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit die T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Als Nächstes doppelklicken Sie auf die eingekreiste Bevölkerung. Wählen Sie im neuen Fenster CD4 auf der y-Achse und CD8 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD4-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD4 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie nun auf Polygon, um die CD8-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD8 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diese Schritte mit den anderen Dateien.

Um die Häufigkeiten von teilenden und nicht dividierenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zunächst die Zellpopulationen, indem Sie auf Layout-Editor klicken. Ziehen Sie dann die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen von jedem der vier Röhren in das Fenster Alle Samples. Diagramme, die Ihre Populationen darstellen, werden angezeigt. Doppelklicken Sie für jede Röhre auf das Punktdiagramm für CD8-T-Zellen, und wählen Sie Histogramm unter Graphendefinition aus, um die Ergebnisse zu visualisieren. Wählen Sie CFSE als Parameter aus, um die stimulierten und nicht stimulierten Zellpopulationen zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Nicht trennende Zellen halten höhere CFSE-Spiegel bei, während sich vermehrende Zellen den Gehalt von CFSE in teilende Zellen aufteilen.

Wenn Sie nun die Umschalttaste drücken, doppelklicken Sie auf das Histogramm. Klicken Sie im neuen Fenster auf den Bereich, und wählen Sie den CFSE-Bereich aus, der dem höchsten Peak entspricht. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundbevölkerung die Grundgesamtheit Nicht dividierende CD8-T-Zellen, und beschriften Sie die Grundgesamtheit, die CD8-Zellen teilt. Wiederholen Sie dies, um die teilenden und nicht teilenden CD4-T-Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3-positiven Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf Tabelleneditor. Ziehen Sie dann die von Interesse interessierten Populationen, teilen Sie CD8 T-Zellen und Teilen von CD4 T-Zellen, in die Tabelle. Wählen Sie im Menü Statistik die Option Frequenz der T-Zellen aus. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen, um die Häufigkeit in einer neuen Tabelle anzuzeigen.

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