Introducción para el lector de microplacas

General Laboratory Techniques

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Summary

El lector de microplacas es un instrumento multimodal que permite una variedad de experimentos para ser realizados y medidos simultáneamente. Los lectores de microplacas pueden hacer mediciones de absorbancia, fluorescencia y luminiscencia. Placas de pocillos son parte integrales del lector de microplacas y permiten muchos experimentos a realizar a la vez. Independientemente del tipo de análisis, experimentos en el lector de la placa utilizan una curva estándar para determinar los valores experimentales. Esta curva utiliza muestras de concentración conocida para generar una línea de mejor ajuste o curva estándar. Valores experimentales a continuación se extrapolan a la curva o se calculan utilizando la ecuación de la regresión lineal. Además de estándares y muestras se ejecuta en la placa multicapa, el espacio en blanco junto con controles positivos y negativos también se utilizan en el ensayo para asegurar que funcione correctamente. Multiplate lectores se utilizan para cuantificar proteínas, expresión génica y diversos procesos metabólicos tales como flujo de calcio y especies reactivas de oxígeno.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Técnicas generales de laboratorio. Introducción para el lector de microplacas. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

El lector de microplacas es un instrumento ampliamente utilizado que permite muchas muestras para medirse al mismo tiempo, como si se realizaron muchos experimentos de la minúsculos a la vez.

Este aparato se utiliza en combinación con placas de pocillos, como del 96 bien la placa.

Independientemente del tipo de experimento con el lector de microplacas, curvas estándar a menudo se utilizan para determinar el valor de las muestras experimentales, así como controles positivos y negativos.

Los lectores de microplacas vienen en diferentes formas, tamaños y configuraciones. Muchos lectores de microplacas tienen capacidad multimodal que permite muchos diferentes ensayos a realizar. Estas modalidades incluyen la capacidad para realizar diferentes tipos de medidas, tales como medidas de absorción, fluorescentes y luminiscentes.

Placas de pocillos son componentes integrales para el lector de microplacas y se utilizan para sostener las muestras que se miden por la máquina. Estas placas pueden ser de diferentes tamaños, tienen diferentes tipos de fondos bien y diferentes números de pozos. El tipo de placa utilizado depende de la prueba.

La bandeja de carga se utiliza para poner la placa de 96 pocillos en la máquina.

Una interfaz de computadora se utiliza típicamente para funcionar el lector de la placa y controlar sus ajustes y parámetros como la longitud de onda y modo. El software de lector de placa tiene una interfaz gráfica de usuario de la placa que le permite seleccionar que wells se cargan con las muestras.

Pipetas multicanales se utilizan a menudo para cargar las placas de varios pocillos. Los embalses tienen las soluciones para la pipeta multicanal.

Pozos a veces pueden ser cargados mediante una pipeta monocanal estándar.

Estándares y las muestras se cargan en duplicado o triplicadas para dar cuenta de los errores de pipeteo. Aquí puede ver una placa cargada por triplicado.

La curva estándar utiliza las muestras con concentraciones conocidas, que dan valores de absorbancia diferente. Esta información se utiliza entonces para crear un gráfico donde se genera una línea de mejor ajuste.

El espacio en blanco se utiliza para determinar el alcance de la medición que no es experimentalmente relevante y es debido a los topes en que la muestra se diluye o reactivos a los que se expone su muestra. Los valores obtenidos de estas mediciones se llaman el "fondo". El espacio en blanco no contiene cualquier muestra.

El control positivo indica si o no el ensayo ha funcionado correctamente. Da un buen resultado. El control negativo es una variable de control que efecto medida no debe observarse. No debe producir cualquier resultado...

Una vez que la placa está configurada, es hora de cargar las muestras. Para evitar medir las muestras mal o carga de la placa de la manera incorrecta, es fundamental para orientar la placa correctamente en la bandeja del cargamento. Recuerde tener cuidado al cargar las muestras en la bandeja, para no forzar la bandeja en el instrumento o coger las extremidades dentro del instrumento.

Una vez que la bandeja se carga, parámetros tales como el modo de longitud de onda y carga bien del orden se encuentran en el software antes de que la placa se lee.

Después de ajustan los parámetros, se lee la placa, y el lector genera una lectura de los valores en el software.

Una vez que se lee la placa, utilice el valor promedio de las muestras en blanco para restar el fondo de todas las muestras incluyendo la curva estándar.

Después de la lectura, los valores de concentración conocida de los estándares se trazan contra sus respectivos valores medidos, absorbancia en este caso.

Cuando los valores han sido trazados, la línea de mejor ajuste se puede calcular mediante una regresión lineal. Esto puede hacerse fácilmente con un programa de hoja de cálculo.

El coeficiente de determinación, una medida estadística de qué tan bien la línea predice los puntos de datos reales, debe ser entre 0.90-0.99, con 0.99 siendo considerado el mejor valor y significa que la línea ajusta a los datos perfectamente.

Utilizando la línea de mejor ajuste, podemos calcular los valores de concentración de las muestras experimentales o controles en cada pozo, conectando en el valor de absorbancia para Y y luego resolver la ecuación para valores de X. concentración pueden estimarse también dibujando una línea desde el valor de la absorbancia en el eje Y a la mejor línea de ajuste y luego hasta el eje X.

Muchos tipos de lectores de microplacas medir absorbancia, que se define como la relación logarítmica de la luz que incide sobre un objeto a la luz transmitida a través de un objeto.

El ensayo de Bradford es un ejemplo de un ensayo de lector de microplacas absorbancia-basado, donde las muestras de proteína se agregan a la placa con el reactivo de "Bradford". Este compuesto se une a las proteínas en la muestra y causar un cambio en la absorbancia.

En ensayos de fluorescente, un fluorocromo es activado por una cierta longitud de onda de la luz y a su vez provoca la excitación del fluorocromo, que emite luz en una longitud de onda diferente.

Cuando se trabaja con reactivos sensibles luz, asegúrese de mantenerlos cubiertos para evitar el fotoblanqueo y arruinar el experimento.

Ensayos luminiscentes emiten luz a través de una reacción química y suelen ser de luciferasa. Luciferase proviene de varias fuentes como luciérnagas. En una reacción de luciferasa, la luz es emitida cuando luciferase encuentra oxígeno, ATP y magnesio en una serie de reacciones.

Ensayos luminiscentes tienen muchas aplicaciones diferentes. Un ejemplo de esta aplicación es medir la producción y detección de especies reactivas del oxígeno en casos de cáncer.

Otros usos, que utilizan los lectores de microplacas, incluyen ensayos de alto rendimiento con 384 y 1536 pocillos. En estos ensayos, las placas son cargadas por un robot. No, no ese tipo de robot. Un robot programable que automatiza el manejo de muestra extremadamente precisa.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para el lector de microplacas. En este video, mostramos lo que un is(A) lector microlate, cómo es used(B), cómo funciona este instrument(C) cómo interpretar datos de lector de microplacas y aplicaciones utilizando un reader(D) de microplaca. Gracias por ver.

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