分子クローニング

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

分子クローニングとは、組み換えDNAをベクター(DNAの担体)に挿入し宿主生物内でそのDNA断片を複製させる一連のテクニックです。DNA断片(目的遺伝子)は、原核生物又は真核生物サンプルから単離できます。目的断片、別名インサート、を単離後、ベクターとインサートを同じ制限酵素で切断し精製します。その精製したベクターとインサートをライゲーションという手法を利用し繋ぎ合わせます。ライゲーション反応を触媒する酵素はリガーゼです。

このビデオでは、主要な実験方法の説明と共に全般的な分子クローニング工程をご覧いただけます。分子クローニング実験の鍵となる、実験戦略の重要性や形質転換したバクテリアコロニーのトラッキング方法、さらに精製したプラスミドにインサートが含まれているか制限酵素処理により確認する方法やシークエンシングによる確認方法も紹介しています。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学・分子生物学の実験法の基礎. 分子クローニング. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

分子クローニングは、このようなプラスミドやウイルスベクターなどの複製車両に原核生物または真核生物源からの組換えDNAを挿入するために使用される技術のセットです。クローニングは、このような遺伝子として、目的とするDNA断片の多数のコピーを作成することをいう。このビデオでは、手順を設定する方法、分子クローニングの様々なステップを学びますと、この技術のさまざまなアプリケーション。

クローニングを開始する前に、少なくとも二つの重要なDNA分子が必要である。最初の、そして最も重要なのは、そうしないと挿入として知られるクローンを作成しようとしているDNA断片を、必要とする。これは、原核生物、真核生物、絶滅生物から来ることができるか、それは実験室で人工的に作成することができます。分子クローニングを使用することにより、私たちは、特定の遺伝子の機能についての詳細を学ぶことができます。

第二に、ベクトルが必要になります。ベクターは、より多くのコピーを作成するか、またはタンパク質から生成する分子生物学のツールと​​して用いたプラスミドDNAである特定の遺伝子。プラスミドベクターの例であり、細菌によって複製される円形、染色体外のDNAである。

プラスミドは、通常、複数のクローニング部位又はMCSを有し、この領域はまた、制限酵素として知られている種々の制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。別のインサートは、結紮と呼ばれる技術によりプラスミドに組み込むことができる。プラスミドベクターはまた、細菌中で複製することができる複製起点を含まれている。さらに、プラスミドは、抗生物質遺伝子を有している。細菌プラスミドを組み込む場合には、抗生物質を含有する培地中で生き残る。これは、正常に形質転換された細菌の選択を可能にする。

インサートとベクターが宿主細胞生物にクローニングし、分子クローニングに使用される最も一般的には大腸菌である。大腸菌が急速に成長し、広く利用可能な多数の異なる市販のクローニングベクターを有する。真核生物では、のように、酵母は、ホスト組織として使用することができますベクトルに対するanisms。

一般的な分子クローニング手順の最初のステップは、任意の細胞型からDNAまたはmRNAから誘導することができる所望のインサートを得ることである。最適なベクトルとその宿主生物は、その後、それらのインサートの種類を基づいて選択されると、何が最終的にそれを行うことになります。ポリメラーゼ連鎖反応、またはPCRに基づく方法は、多くの場合、インサートを複製するために使用される。

一連の酵素反応を利用して、その後、インサートおよびダイジェストを接合し、質量複製のための宿主生物に導入される。複製されたベクターは、細菌から精製し、制限酵素消化後、ゲル上で分析される。ゲル精製したフラグメントは、後で挿入図は、目的とするDNA断片であることを確認するために配列決定のために送られる。

のが行われているどのように分子クローニングでもう少し詳しく見てみましょう。開始する前に、前のベンチで、任意のクローニングの試みを行うことに、あなたのクローニング戦略を計画したいと思うでしょう。のために例えば、任意のプラスミドベクターは、マルチクローニングサイトを経由して、インサートを組み込むための制限部位の有限数を提供します。あなたはそれを切断しないようにあなたの挿入で発見されていない制限部位を選択する必要があります。あなたは、あなたがオーバーハングを持つもので平滑末端断片を結合することを余儀なくされている状況に残っている可能性があります。もしそうなら、平滑末端ライゲーションを設定するクレノウフラグメントを使用すると、ご希望のベクターに挿入を取得するための唯一の選択肢かもしれません。あなたの処分で、様々な分子クローニングツールを理解するだけでなく、クローン作成を開始する前に、慎重に戦略を考え出すと、莫大な時間を節約することができます。

分子クローニングのためのDNAのソースは、単純な抽出技術を介して細胞または組織試料のほぼ任意のタイプから単離することができる。一度単離され、PCRは、インサートを増幅するために使用することができる。

インサートは、それの両方が増幅され、ベクターを制限酵素によって消化されると、としても知られている制限エンドヌクレアーゼ。

一度消化、インサートとベクターはゲル上で実行し、ゲル精製と呼ばれるプロセスによって精製することができる。ベクトルに関しては、このステップは、ゲル上で高分子量スメアとして表示する傾向がある、ノーカットプラスミドからのプラスミド直鎖状に精製するのに役立ちます。

DNAリガーゼと呼ばれる酵素を介して、消化を浄化ゲルの後、インサートが連結しまたはプラスミドに参加。

一般的に言えば、それはベクトルの少量のみが自己ライゲーションすることを保証する、ベクトルにインサートの比率が3対1になるように、常にライゲーションを設定することをお勧めします。ライゲーションが氷の上に設定されていると、それは14-25から˚Cで1時間から一晩にどこでもインキュベートする。

次に、変換がそれを複製するホストプラスミドベクターを導入するために行われる。

以下の形質転換菌を37℃で一晩インキュベートし、抗生物質を寒天プレート上に播種する。 plasimidは抗生物質解像度が含まれているため、抗生物質の存在下で寒天プレート上で増殖させた場合istance遺伝子形質転換の成功は、細菌のコロニーを生成する。個々のコロニーは、次いで、形質転換プレートから採取奇数チューブ内の液体増殖培地に入れ、膨張振盪インキュベーターに入れることができる。培養物の残りの部分はプラスミド精製に移動しながら培養液の小体積は、奇数寒天プレートに添加する。プラスミドは、最終的に精製されるから、細菌コロニーのIDを示しておりナンバリング方式をプラスミド精製プロセス全体を通して維持される。

プラスミドの精製サンプルを、次いで、制限酵素で切断される。ダイジェストは、その後、細菌コロニーをインサートとしないセルフライゲーションプラスミドを含むプラスミドで形質転換されたことを確認します挿入物の存在、をチェックするためにロードされ、ゲル上で実行されます。インサートを含むプラスミドで形質転換されたことが検証細菌は、ファースために展開されるERプラスミド精製。配列決定は、関心のある遺伝子がクローニングされていることを確認するための最終検証ステップとして行わ用いられる。

分子クローニングは、アプリケーションの近くに無限の数のために使用することができます。例えば、時のmRNAテンプレートは、逆転写酵素と呼ばれる酵素によってcDNAを、または相補的DNAを形成するために逆転写され、次いで、PCR cDNAを、分子クローニングは、cDNAライブラリーを作成するために使用することができる増幅するために使用されている - のすべてのライブラリー所与の細胞型によって発現される遺伝子。

分子クローニングは、別系統で変換されるため、全体の生合成経路が複雑な分子を生成するように再作成することができるプラスミドにそれらを再編成する一細菌株からの一連の遺伝子、または遺伝子クラスターを取るために用いることができる。

分子クローニングを通じ、変異​​体ライブラリーを培養したときにエラーが発生しやすいポリメラーゼを使用する特殊な細菌株においてプラスミド標的を発現することによって生成することができます一定の温度で。突然変異は配列決定によって特徴付けることができる。変異遺伝子で形質転換された細菌は、次いで細菌のコロニーが薬剤耐性を持つように進化してきたかを確認するために、異なる薬物または化学物質を使用してテストすることができる。

分子クローニングのおかげで、レポーター遺伝子は、DNAプラスミドに組み込むことができ、一般的なレポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質又はUV光に曝されたときに、緑色の蛍光を発するGFPである。レポーター遺伝子は、細胞内の蚊と伝達における感染を表示するためにアルファに挿入することができる。

あなただけの分子クローニングにJoVEsのビデオを見てきた。あなたは今、分子クローニングのしくみと技術が分子生物学で使用することができますどのように理解しておく必要があります。いつものように、見てくれてありがとう!

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