Le clonage moléculaire

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

Le clonage moléculaire est un ensemble de méthodes, qui sont utilisées pour insérer un ADN recombinant dans un vecteur – un porteur de molécules d'ADN qui va répliquer les fragments d'ADN recombinant dans les organismes hôtes. Le fragment d'ADN, qui peut être un gène, peut être isolé depuis un spécimen procaryote ou eucaryote. Après l'isolation du fragment d'intérêt, ou insert, le vecteur et l'insert doivent être coupés avec les enzymes de restriction et purifiés. Les morceaux purifiés sont unis via une technique appelée ligation. L'enzyme qui catalyse la réaction de ligation est connue sous le nom de ligase.

Cette vidéo explique les méthodes principales qui sont combinées, en tandem, pour faire partie de la procédure globale de clonage moléculaire. Les aspects critiques du clonage moléculaire sont discutés, tels que le besoin d'une stratégie de clonage moléculaire et comment suivre la trace des colonies bactériennes transformées. Les étapes de vérification, comme la vérification dans les plasmides purifiés de la présence d'insert avec digests de restriction et le sequençage, sont aussi mentionnés.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Le clonage moléculaire. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Clonage moléculaire est un ensemble de techniques utilisées pour insérer l'ADN recombinant à partir d'une source procaryote ou eucaryote dans un véhicule tel que la réplication des plasmides ou des vecteurs viraux. Le clonage consiste à faire plusieurs copies d'un fragment d'ADN d'intérêt, par exemple un gène. Dans cette vidéo, vous apprendrez tout sur les différentes étapes de clonage moléculaire, comment mettre en place la procédure, et les différentes applications de cette technique.

Au moins deux molécules d'ADN importantes sont nécessaires avant que le clonage commence. Tout d'abord, et surtout, vous avez besoin du fragment d'ADN que vous allez cloner, autrement connu comme l'insert. Il peut provenir d'un procaryote, eucaryote, un organisme éteint, ou il peut être créé artificiellement en laboratoire. En utilisant le clonage moléculaire, nous pouvons en apprendre davantage sur la fonction d'un gène particulier.

Deuxièmement, vous avez besoin d'un vecteur. Un vecteur est l'ADN du plasmide utilisé comme un outil en biologie moléculaire pour faire plus de copies ou de produire une protéine à partir deun certain gène. Les plasmides sont un exemple d'un vecteur, et sont circulaires, extra chromosomique, l'ADN qui est répliqué par des bactéries.

Un plasmide possède typiquement un site de clonage multiple ou MCS, cette région contient des sites de reconnaissance pour des endonucléases de restriction différentes aussi connu que les enzymes de restriction. Différents inserts peuvent être incorporés dans le plasmide par une technique appelée ligature. Le plasmide vecteur contient également une origine de réplication, ce qui lui permet d'être répliqué dans des bactéries. En outre, le plasmide a un gène antibiotique. Si les bactéries intègrent le plasmide, il va survivre dans des milieux qui contient l'antibiotique. Ceci permet la sélection des bactéries qui ont été transformées avec succès.

L'insert et le vecteur sont clonées dans un organisme de la cellule hôte, le plus couramment utilisé dans le clonage moléculaire est E. coli. E. coli se développe rapidement, est largement disponible et a de nombreux différents vecteurs de clonage produits dans le commerce. Eucaryotes, comme, levure peuvent également être utilisés comme org hôtenismes de vecteurs.

La première étape de la procédure générale de clonage moléculaire est d'obtenir l'insert souhaité, qui peut être dérivée à partir de l'ADN ou de l'ARNm à partir de n'importe quel type de cellule. Le vecteur optimal et son organisme hôte sont alors choisis-elles fondées type d'insert et ce seront finalement fini avec elle. Une réaction en chaîne de la polymérase, ou une méthode basée sur la PCR est souvent utilisé pour reproduire l'insert.

Ensuite, à l'aide d'une série de réactions enzymatiques, et l'insert de digestion sont jointes ensemble et introduits dans l'organisme hôte pour la réplication massive. Vecteurs répétés sont purifiés à partir de bactéries, et après digestion de restriction, analysés sur un gel. Fragments purifiés sur gel sont ensuite envoyés pour le séquençage de vérifier que le médaillon est le fragment d'ADN souhaité.

Ayons un regard un peu plus détaillée sur la façon dont le clonage moléculaire est effectuée. Avant de commencer, vous voudrez planifier votre stratégie de clonage, avant de faire toute tentative de clonage sur le banc. PourAinsi, tout vecteur plasmidique donné, vous fournira un nombre limité de sites de restriction d'intégrer l'insert via le site de clonage multiple. Vous aurez besoin de choisir des sites de restriction qui ne figurent pas dans votre insert de sorte que vous n'avez pas cliver. Vous pourriez vous retrouver avec une situation où vous êtes obligé d'adhérer à un fragment d'extrémité émoussée avec celui qui a un faux. Si oui, puis en utilisant le fragment de Klenow de mettre en place une ligature fin brutale pourrait être votre seule option pour obtenir l'insérer dans votre vecteur désiré. Comprendre les différents outils de clonage moléculaire à votre disposition, ainsi que venir avec une stratégie prudente avant de commencer le clonage peut être un gain de temps immense.

La source d'ADN pour le clonage moléculaire peut être isolé de n'importe quel type de cellule ou un échantillon de tissu au moyen de techniques d'extraction simple. Une fois isolé, PCR peut être utilisée pour amplifier l'insert.

Une fois que l'insert est amplifié à la fois et le vecteur sont digérés par les enzymes de restriction, également connu sous le nomdes endonucléases de restriction.

Une fois digéré, l'insert et le vecteur peuvent être exécutés sur un gel et purifiés par un processus appelé la purification de gel. En ce qui concerne le vecteur, cette étape permettra de purifier plasmide linéarisé depuis uncut plasmide, qui tend à apparaître comme une traînée de haut poids moléculaire sur un gel.

Après gel purifiant le digère, l'insert est lié ou relié au plasmide, via une enzyme appelée ADN ligase.

D'une manière générale, il est toujours une bonne idée de mettre en place des ligatures, de sorte que le rapport de l'insert au vecteur est de 3 à 1, ce qui assure que seule une petite quantité de vecteur s'auto-ligate. Une fois la ligature a été mis en place sur la glace, il est incubé n'importe où de 14 à 25 ˚ C à ​​partir de 1 h à la nuit.

Ensuite, la transformation est effectuée pour introduire le vecteur plasmidique dans l'hôte qui le reproduire.

Les bactéries de transformation suivants sont étalées sur des boîtes de gélose avec des antibiotiques et incubées une nuit à 37C. Parce que le plasimid contient une résolution antibiotiquesgène istance, transformation réussie produira des colonies de bactéries lorsqu'elles sont cultivées sur gélose en présence d'antibiotiques. Des colonies individuelles peuvent ensuite être récupérés à partir de la plaque transformé, placés dans un milieu de culture liquide dans des tubes numérotés et placés dans un incubateur agitateur d'expansion. Un petit volume de culture liquide est ajouté à une plaque de gélose numérotée, tandis que le reste de la culture passe à la purification de plasmide. Le système de numérotation qui représente l'identité de colonies bactériennes à partir de laquelle les plasmides seront éventuellement purifié est maintenu tout au long du procédé de purification de plasmide.

Un échantillon du plasmide purifié est ensuite coupé par les enzymes de restriction. Le résumé est alors chargé et exécuté sur le gel afin de vérifier la présence de l'insert, ce qui permettra de vérifier que la colonie bactérienne a été transformée avec un plasmide contenant un insert et non auto-ligaturé plasmide. Les bactéries vérifiées avoir été transformée par un insert plasmide contenant, sont développés pour Further purification de plasmide. Le séquençage est utilisée exécutée comme une étape de vérification finale pour confirmer que votre gène d'intérêt a été cloné.

Le clonage moléculaire peut être utilisé pour un certain nombre quasi illimitée d'applications. Par exemple, lorsqu'un modèle de l'ARNm est une transcription inverse pour former un ADN d'ADNc, ou complémentaires, par une enzyme appelée transcriptase inverse et PCR est utilisée pour amplifier l'ADNc, le clonage moléculaire peut être utilisée pour créer une bibliothèque d'ADNc - une bibliothèque de tous les gènes exprimés par un type cellulaire donné.

Le clonage moléculaire peut également être utilisé pour prendre une série de gènes, ou groupe de gènes d'une souche bactérienne, les réorganiser dans des plasmides qui sont transformés en une autre souche, donc une voie de biosynthèse tout peut être recréé pour produire une molécule complexe.

Par clonage moléculaire, une banque de mutants peuvent être générés par l'expression d'un plasmide cible d'une souche bactérienne particulière qui utilise une erreur polymérase sujette lorsqu'elles sont cultivéesà certaines températures. Les mutations peuvent être caractérisés par séquençage. Les bactéries transformées avec des gènes mutants peuvent alors être testés avec la drogue ou des substances chimiques différentes pour voir laquelle des colonies bactériennes ont évolué pour avoir une résistance aux médicaments.

Merci de clonage moléculaire, les gènes rapporteurs peuvent être incorporés dans des plasmides d'ADN, un gène rapporteur commune est la protéine fluorescente verte ou la GFP, qui émet une fluorescence verte lorsqu'elle est exposée à la lumière UV. Un gène rapporteur peut également être inséré dans un alphavirus de montrer infection chez les moustiques et la transmissibilité dans les cellules.

Vous avez juste regardé Joves vidéo sur le clonage moléculaire. Vous devez maintenant comprendre comment le clonage moléculaire fonctionne et comment la technique peut être utilisée en biologie moléculaire. Comme toujours, merci pour l'observation!

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