神经组织的组织学染色

Neuroscience

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Summary

为了检测组织和器官中的细胞,结构和分子的布局,研究人员使用一种被称为组织学染色的方法。在该技术中,感兴趣的组织被用化学固定剂保存并切片,或切成非常薄的切片。然后应用各种染色技术为这些看起来均一的切片提供对比度。在神经解剖学的研究中,组织学技术被经常用来观察和研究神经系统组织。

这段视频着重于神经组织的组织学染色技术。概述了常见的大脑组织染色,包括那些特异性标记神经元细胞体的方法,如尼氏染色,和那些有选择地突出显示髓鞘化的轴突的方法,如罗克沙尔固蓝染色。还讨论了免疫组化技术,该技术利用抗体和特定细胞蛋白之间的特异性相互作用。接下来,描述了制备用于染色的脑组织样品,包括固定,包埋,切片和复水组织的基本步骤。本短片还提供了免疫组织染色后进行尼氏染色的逐步过程,以及这些技术的实际应用。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 神经组织的组织学染色. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

脑组织的薄切片,或切片,是研究大脑结构和功能的丰富材料。然而,未经处理的大脑看上去就是一个均一的组织,如同一张空白的画布。染色是一种“画”大脑的方法,以使我们能清楚地看出该器官的细胞,结构和分子组成部分。尽管大多数的染色使用共同的组织学方法,但每一种染色都有其独特的形态学目标。本短片将概括脑组织学的大致原理,演示一些常用的染色技术,并回顾这些方法在当今的神经科学实验室中的一些应用。

在讨论如何进行神经组织染色步骤前,让我们先回顾一下这些技术的目的。

组织学染色通常用于提供对比度,从而显示出在未染色的组织中无法辨认的特征。例如,要看清构成神经系统灰质的神经元细胞体或胞体,有多个染色方法可用。在尼氏染色中所使用的染料附着于核酸上,可将胞体染成紫色从而显示出神经元组织。

如果要想看白质,您可以染色髓鞘 –也就是围绕神经轴突的脂肪酸鞘,通过使用类似罗克沙尔固蓝的染料来染色。此外,免疫组化染色可以突出显示特定细胞类型中的分子靶点。该技术利用抗体和作为抗原的目标分子之间的特异性。使用的抗体融合了酶或荧光化合物,使得研究人员能够通过酶促反应或荧光来看到它们的结合位点。

现在您已经对染色切片有了了解,让我们来看看进行脑组织染色和确保观察的最佳条件的常用组织学步骤。

为保持组织结构,首先要将大脑灌注 - 即将血液从大脑排出并用一种化学固定剂来灌注动物的血管系统。解剖完成后,将大脑完全浸入固定液中以完成保存过程。

接着将标本包埋在与大脑组织具有类似机械性能的介质中,如石蜡。包埋后,用被称为切片机的仪器将大脑切成薄切片,然后将切片帖在载玻片上,并让其干燥。

由于多数染料是水性染料,在染色开始前,需先将组织进行脱蜡和再水化处理。为此,要用二甲苯漂洗切片以溶解石蜡,然后用一组稀释度递加的乙醇溶液逐渐复水。这个过程应在通风橱中进行,并要穿着适当的个人防护装备。

准备好大脑组织后,您现在就可以开始染色了。

第一步称为封闭,用以减少由非特异性抗体结合而造成的背景染色。将切片浸泡在血清中,使未标记的抗体结合到非靶标位点上。封闭30分钟到过夜,就可将组织与一抗孵育了,一抗结合特定的分子靶点。

抗体通常是稀释在含去污剂的封闭溶液中,去污剂可以破坏细胞膜,使得抗体进入细胞质。

过夜孵育后,在缓冲液中短暂洗涤去除 多余的一抗。接下来,加入耦合了酶或荧光基团的二抗,来特异性结合一抗。几小时后,多次换缓冲液来洗涤去除过量的抗体。

现在,目的蛋白已经被标记上了,让我们来谈谈如何检测它们。对于酶联的二抗,是通过加入显色底物来完成。当底物与酶相互作用,颜色会发生变化,因此称为“显色”。一旦达到所需的染色,通常为2分钟后,迅速将切片浸于水中停止反应。

抗体染色后,可能仍然需要第二步来提供一些神经解剖学方面的结果。例如,您可以选择用尼氏染色来增强组织对比度。这个过程是凭借碱性染料如甲酚紫,与核酸之间的相互作用。

第一步是过滤染料溶液以除去未溶解的晶体。接下来将载玻片与染色液孵育,直到达到所需的对比度。然后,多次换水清洗切片,中止染色。

然后将载玻片浸入梯度乙醇溶液中以清除过量的染色并脱水切片。脱水后,用二甲苯将切片变透明,这一步除去酒精,并提高了成像结果,因为它具有类似于组织的光衍射特性。

为了保存染色的切片以供日后分析,加上永久性的封片剂并盖上盖玻片,干燥过夜。

现在,我们已经介绍了染色的步骤和目的,让我们来看看一些应用。

首先,组织学染色被常规用于观察单个神经元。反过来,将脑组织可视化也是很多技术所必需的,如激光捕获显微切割技术,其中研究人员使用激光分离生长在薄膜上的特定的细胞。可从染色并切割下的细胞中提取遗传物质,使研究人员能够研究神经元特异性基因的表达。

染色也可以用于鉴定单个神经元的形态学特征。在这个实验中,用免疫组化染色表达GFP的细胞,来观察形成突触的树突。比较正常和激活细胞的染色结果,可显示树突响应激活刺激时发生了多种变化。

最后,由于IHC的特异性,个别蛋白质的表达可以被用来识别神经系统中独特细胞群的位置和特性。例如,用zebrin2抗体染色小鼠小脑显示出被称为浦肯野细胞的特定神经元的位置。

您刚观看的是JoVE对脑组织切片定点染色的介绍。本短片中,我们说明了染色的一般方法和目的,还介绍了IHC和尼氏染色的具体过程。感谢观看!

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