神经组织的外值体培养

Neuroscience
 

Summary

脊椎动物神经系统的精细结构产生于一系列涉及细胞分化,细胞迁移和细胞形态变化的复杂事件。研究这些过程对于我们了解神经系统功能,诊断和治疗发育异常导致的疾病极为重要。然而,神经组织相对无法得到实验处理,尤其是在哺乳动物的胚胎内。因此,许多科学家利用外植体培养,来在“器官型培养”的环境下研究神经发育过程,也就是将组织从生物体中取出,但仍保留其复杂的细胞结构。概括地说,获得外植体培养物就是仔细分离出神经组织,然后将其浸没在精心设计的生长培养基中,进行体外培养。

本短片将首先简要介绍神经外植体培养,包括它与其他体外方法相比的优势,和维持健康组织的重要考虑因素。接着,提供了一个从胚胎小鼠大脑建立起外植体培养的通用方法,概述从母体上分离胚胎和解剖大脑过程。本短片还包括了薄片培养的介绍,用该方法得到的神经系统的薄切片使得能更容易地观察发育中的细胞。最后,将演示这些技术的一些应用以说明它们是如何被用来回答神经发育领域的重要问题的。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 神经组织的外值体培养. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

外植体培养这种技术用于研究特定细胞群和神经结构的发育。在发育神经学实验中,外植体是从胚胎上分离得到并在体外继续发育的神经组织。这些培养物使得研究人员能够操作和观察发育中的组织,这在体内实验中是无法做到的。本短片将介绍操作外植组织背后的一些重要原理,逐步讲解外植体培养的两种方法,以及这项技术的应用。

在深入介绍方法之前,让我们来了解一些基本原理。外植体可以从多种模式生物和许多不同类型的组织中获得。概括地说,获得外植体培养物就是从胚胎中仔细分离出神经组织,将感兴趣的部分解剖出来,并将其放置到一个人造环境中培养。组织还可被切成薄片,以“薄片培养”的方式生长。由于培养环境被设计成模拟整个器官的体内条件,这种培养手段通常被称为“器官型培养”。

开始之前,一定要用70%的乙醇消毒您的器具。再用您所在实验室推荐的方法安乐死处置怀孕的小鼠。然后,手术切出子宫并置于冰冷的缓冲液中。将培养皿转移至解剖镜下,从卵黄囊中剥离出单个胚胎。接下来,分离出脑器官,并仔细地解剖出您感兴趣的区域,将其转移到含有培养基的培养皿中。外植体可以在37度,含5%CO 2的培养箱中培养几周,期间每隔2-3天更换一半的培养基。

脑组织的切片培养需要几个额外的步骤。切片前,需先将组织包埋在琼脂糖中,它支撑住组织使其在被切片时保持完整。为达到此目的,先加热1.5%的低熔点琼脂糖溶液直至琼脂糖溶化。然后,将琼脂糖转移到包埋模具中并使其稍微冷却,以避免损伤组织。接下来可小心将组织浸没到琼脂糖中,并让琼脂糖冷却变硬。再修整得到的琼脂糖块,并将其粘在样品载物台上,使用振动切片机切片。这是一种使用振动的刀片将生物体组织切成薄片的仪器。得到切片后,将它们小心地转移至含有培养基的包被培养板上,如前所叙进行培养。

相对于体内和其他体外方法,使用外植体培养有许多优点。首先,外植组织的细胞更容易被实验操作。其次,外植体仍保持发育中神经组织的复杂细胞结构,这意味着可以对细胞与细胞间的相互作用进行研究。第三,由于科学家们能够人为控制培养基的化学成分,他们就可以使用外植体来测试特定化合物对组织发育的影响。

然而,由于外植体是被从它的天然环境中分离出来的,要在体外维持旺盛健康的组织需要有特别的处理。例如,细胞外基质ECM的存在,对细胞的行为有着显著的影响,因此纯化的细胞外基质蛋白通常用于包被培养皿。另一个重要的因素是浸泡外植体的溶液。虽然通常使用传统的细胞培养液,但有些实验需要使用与在中枢神经系统中流动的液体-脑脊液非常相似的液体,这也是您将要看到的实验中的关键试剂。

现在,我们已经介绍了外植体培养的方法,让我们来看看这些技术是如何应用的。

细胞迁移分析使用移植的组织来检测包括在神经细胞运动中起作用的排斥和吸引信号。在这个实验中,在生长因子里预先浸泡过的珠子被植入到后脑外植体中,用以研究神经细胞的迁移。3 - 4天后,用共聚焦显微镜对神经元成像。结果表明,运动神经元朝向浸泡过血管内皮细胞生长因子的珠子迁移,但不朝向浸泡在缓冲液中的对照珠子迁移。

共培养测定法通常用于研究发育过程中细胞与细胞间的相互作用。在这个例子中,脊髓节段被培养在一层肌细胞上用以研究脊髓运动神经元和骨骼肌之间是如何进行连接的。最早在培养两天后,神经元的突起,也就是神经突,会被发现开始从外植体上形成。在 5天内,就可以通过肌细胞层的收缩观察到功能性的神经分布。

在神经系统的发育中,神经元必须伸长它的轴突来在目标组织和中枢神经系统之间建立连接。研究这种复杂过程的方法之一是通过轴突导向分析。研究人员使用外植组织来研究存在于神经元内和其周围环境中,帮助引导轴突到达其正确位置的因子。

您刚观看的是JoVE对神经组织外植体培养的介绍。本短片概述了外植体培养的优点,培养的手段,两个常用的外植体技术的详细实验步骤以及这些技术在今天的实验室中的应用。感谢观看!

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