Análisis de la metilación de DNA

Genetics

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Summary

Metilación en dinucleótidos CpG es una modificación química del ADN presumido para desempeñar un papel importante en la regulación de expresión génica. En particular, la metilación de los grupos de sitios de metilación, llamados "Islas CpG", promotores y otros elementos regulatorios del gen puede contribuir a silenciar estable de genes, por ejemplo, durante los procesos epigenéticos como impresión genómica y la inactivación del X-cromosoma. Al mismo tiempo, la metilación CpG aberrante ha demostrado para ser asociado a cáncer.

En este video, las funciones biológicas y los mecanismos de metilación del ADN se presentará, junto con diferentes técnicas utilizadas para identificar los sitios de metilación en el genoma. Luego examinaremos los pasos del análisis de bisulfito, uno de los más utilizados métodos de detección de metilación del ADN, así como varias aplicaciones de esta técnica.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la genética. Análisis de la metilación de DNA. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Metilación del ADN es una modificación química del ADN que afecta la expresión génica en diferentes contextos celulares. Muchos investigadores están interesados en el mecanismo y funciones de este proceso, como la metilación aberrante del ADN se ha asociado con enfermedades como el cáncer.

En este video, cubrimos los principios detrás de la metilación del ADN y los métodos para detectarlo. Entonces, vamos a explorar un protocolo general para uno de estos métodos, análisis de bisulfito y algunas aplicaciones de esta técnica.

En primer lugar, echemos un vistazo a lo que la metilación del ADN es y cómo puede detectarse.

Durante este proceso bioquímico, una célula agrega una etiqueta química conocida como un grupo metilo a las bases de citosina en su ADN. Más metilados cytosines ocurren al lado de bases de guanina en el mismo filamento de la DNA y estos nucleótidos adyacentes y el enlace fosfodiéster que une — se conocen como "GPC". Aunque está metilados CpGs vertebrados la mayoría, aquellos que están unmethylated tienden a ocurrir juntos en "Islas CpG" cerca de los promotores de activamente expresados genes y varios otros elementos de la secuencia reguladora.

Cómo cambios en la metilación del ADN contribuyen a la regulación de los genes es todavía un tema de intensa investigación. La metilación de islas CpG parece ser importante para el silenciamiento del gen estable, a largo plazo en procesos epigenéticos como impronta genómica, que es la expresión concreta de padres de origen de determinados genes, así como la inactivación del X-cromosoma, el silenciamiento de uno de los dos X-cromosomas en cada célula de los mamíferos hembra. Represión de los genes críticos debido a la metilación aberrante de las islas de CpG también se ha demostrado para contribuir al crecimiento incontrolado de la célula, que puede conducir a cáncer. Mecánico, metilación del ADN puede contribuir a la gene que silencia por cualquiera de los dos factores de transcripción prevención de asociar con los promotores, o mediante la contratación de proteínas que modifican las histonas y remodelación de la cromatina en un estado transcripcionalmente permisiva.

Existen varios métodos para detectar el estado de metilación del ADN.

Una de las técnicas, el análisis de la ayuda, implica dos endonucleasas de restricción que se llama HpaII y MspI, que respectivamente se hienden solamente unmethylated o metiladas y unmethylated, secuencias CCGG. Al comparar los patrones de digestión producidos por estas dos enzimas, puede deducirse el estado de metilación del ADN.

Otro método, llamado metilado ADN inmunoprecipitación o "MeDIP," utiliza los anticuerpos que se unen a cytosines metilados para enriquecer para secuencias de ADN metiladas.

Por último, análisis de bisulfito se utilizan para distinguir metilado de unmethylated citosina en el ADN, llevando a cabo una reacción química que convierte unmethylated citosina en uracilo. Después de esta conversión, DNA bisulfito-tratada puede ser sometido a PCR secuenciado y Comparado con un genoma de referencia. Unmethylated cytosines son aquellos que están presentes en la referencia, pero reemplazado por thymines tras análisis de bisulfito y PCR. Al someter la DNA bisulfito-tratada para espectrometría de masas, los investigadores también pueden crear "epigramas de metilación", que representan diferentes GPC en el genoma lineal y representan el grado de metilación en cada uno de ellos. Estos epigramas son particularmente útiles si los investigadores quieren comparar patrones de metilación entre los diferentes tipos de células.

Ahora echemos una mirada en profundidad en el protocolo para el análisis del bisulfito.

Para empezar, hidróxido de sodio se agrega a las preparaciones de la DNA genomic, que luego se incuban a 95° C. Esto desnaturaliza el DNA y hace sus bases accesibles a las reacciones químicas posteriores. Metabisulfito de sodio entonces se introduce en la mezcla de ADN desnaturalizada, y dos pasos de la reacción química ocurrirá. Durante el primer paso, sulfonación, un sulfito grupo se agrega a una citosina unmethylated para formar sulfonato de citosina. Luego, durante la desaminación hidraulicos, un grupo amino es eliminado de sulfonato de citosina para generar sulfonato de uracilo.

Para facilitar estas primeras etapas de la reacción química, la preparación de ADN es cubierta con aceite mineral, que evita la evaporación y ayuda a mantener la concentración de metabisulfito de sodio. Entonces, la reacción se incuba a 55° C en la oscuridad. Durante este paso, un agente para evitar la oxidación, como quinol, también se agrega a la mezcla.

Para recoger el ADN modificado que contiene sulfonato de uracilo y no aceite mineral, se centrifuga la mezcla y la capa más baja del líquido recuperado. Luego se purifica el ADN en esta solución.

A continuación, se agrega hidróxido de sodio a la mezcla de ADN, que luego se incubaron a 37° C. Esto se hace para inducir la desulfonation, que, como puede haber adivinado, elimina el grupo sulfito de sulfonato de uracilo, formando uracilo y completando la reacción química.

Finalmente, la mezcla se neutraliza con la adición de acetato de amonio, y el ADN se recoge por la precipitación del etanol. Una vez que la DNA bisulfito-convertido ha sido purificada, se somete a la PCR y secuenciación.

Ahora que hemos hablado la técnica básica para el análisis del bisulfito, echemos un vistazo a algunas aplicaciones experimentales.

Algunos investigadores utilizan análisis de bisulfito para investigar la impresión genomic. Aquí, los investigadores cruzaron dos cepas de Arabidopsis con diferencias genéticas, así que madre y ADN paterno se distinguen. Luego se compararon los patrones de metilación en los embriones resultantes y endospermo asociado o el tejido que soporta el embrión. Usando este método, los científicos encontraron que GPC en el alelo maternal de un gen de codificación de la proteína, MEA, tendía a ser desnaturalizado en embriones pero unmethylated en endospermo, indicando la impresión de tejidos específicos.

Otros investigadores utilizan esta técnica para comprender factores como ambientales o sociales puede alterar los patrones de metilación. Aquí, crías de ratón fueron separados de sus madres para inducir el estrés, y sus tejidos de cerebro fueron posteriormente aislados. Siguiendo la secuencia de la DNA bisulfito-tratada, científicos determinaron que los patrones de metilación de un gen de codificación de la hormona, AVP, cambiaron en una región específica del cerebro en cachorros "separados", lo que sugiere un posible mecanismo molecular de efectos biológicos a largo plazo de la primera experiencia de vida.

Finalmente, muchos investigadores están tratando de optimizar el análisis de bisulfito para facilitar la comparación de patrones de metilación entre las células individuales y únicos. Aquí, los investigadores modifican el método de análisis de bisulfito para que todos los pasos fueron realizados en ovocitos de ratón individuales encajados agarosa, que ayudó a proteger contra la pérdida de ADN. Usando este método, los investigadores fueron capaces de identificar fácilmente las muestras solo ovocito que habían sido contaminadas con otras células por buscando a aquellos que dieron varios patrones de metilación.

Sólo has visto video de Zeus en el sensible análisis de metilación. Aquí, hemos analizado el papel que juega la metilación del ADN en la regulación génica, métodos que los investigadores utilizan para identificar regiones metiladas en el genoma, un protocolo generalizado para el análisis del bisulfito y finalmente, algunas aplicaciones de esta técnica. ¡Como siempre, gracias por ver!

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