DNA 甲基化分析

Genetics

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Summary

在中央人民政府酯基的甲基化是假设要发挥重要作用的调节基因表达的 DNA 化学修饰。尤其是,甲基化甲基化网站,叫做"CpG 岛",发起人和其他基因调控元件附近集群可能有助于稳定沉默基因,例如,表观遗传过程基因组印迹、 x 染色体失活等。同时,CpG 甲基化已被证明是与癌症相关联。

在这个视频中,生物学功能和 DNA 甲基化的机制将提交,用于标识在基因组甲基化网站的各种技术。我们会研究亚硫酸分析的步骤,其中最常用的方法检测 DNA 甲基化,以及这种技术的若干应用。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遗传学精要. DNA 甲基化分析. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

DNA 甲基化是影响基因表达在不同细胞背景下的 DNA 化学修饰。许多研究人员感兴趣的机制与功能的这个过程中,如 DNA 甲基化已经与癌症等疾病相关联。

在本视频中,我们将介绍 DNA 甲基化和方法检测到它背后的原理。然后,我们将探讨这些方法、 亚硫酸氢盐分析和一些应用这种技术之一的通用协议。

首先,让我们看看什么的 DNA 甲基化和如何可以被检测到。

在这个生化的过程中,单元格添加化学标记称为甲基胞嘧啶碱基在 DNA 中。最甲基胞核嘧啶发生在相同的 DNA 链和这些相邻核苷酸鸟嘌呤基地 — — 和联系在一起,磷酸二酯键 — — 统称为"Cpg。"虽然大多数脊椎动物 Cpg 甲基化,那些非甲基化倾向于靠在一起发生在中央人民政府"岛"附近的创办人,活跃表达基因和各种其他调控序列元素。

DNA 甲基化变化如何贡献基因调控仍是紧张调查的主题。甲基化的 CpG 岛似乎是重要的看到例如基因组印记,是父原产地的某些基因,以及 x 染色体失活,沉默的两条 x 染色体中每个单元格的雌性哺乳动物之一的特异性表达的表观遗传过程中稳定、 长期的基因沉默。镇压的关键基因的异常甲基化 CpG 岛也证明有助于细胞生长失控,这可能会导致癌症。机械化,DNA 甲基化可导致基因沉默由从关联启动子,或者防止转录因子或招聘修改组蛋白和染色质重塑为转录非许可状态的蛋白质。

有几种方法用于检测 DNA 甲基化状态。

一种技术,帮助测定,涉及到两种限制酶称为自置居所津贴II 和MspI 分别切割只甲基化或甲基化和非甲基化,CCGG 序列。通过比较形成这两种酶的消化图案,可以推导出 DNA 的甲基化状态。

另一种方法,称为甲基化 DNA 免疫共沉淀或"MeDIP,"使用绑定到甲基胞核嘧啶以充实为甲基化的 DNA 序列的抗体。

最后,亚硫酸氢分析用于区分从 dna,非甲基化胞嘧啶甲基化进行一种化学反应,将非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶。此转换之后,亚硫酸氢盐处理的 DNA 可以遭受 PCR、 测序,和相对于一个参考基因组。非甲基化胞核嘧啶是那些存在于引用,但是替换采用亚硫酸氢盐分析和 PCR 之后。使遭受质谱的亚硫酸氢盐处理的 DNA,研究人员还可以创建"甲基化警句,"线性代表不同 Cpg 基因组中的并描绘了每次甲基化程度。这样的警句是特别有用的如果研究人员想要比较不同细胞类型之间的甲基化模式。

现在让我们深入看看亚硫酸分析的协议。

若要开始,氢氧化钠被添加到筹备工作的基因组 DNA,然后孵化在 95 ° c。这变性的 DNA,并使其基地可随后化学反应。焦亚硫酸钠然后引入变性的 DNA 混合物,和两个化学反应步骤将会发生。期间的第一步、 磺化、 亚硫酸盐组添加到非甲基化胞嘧啶,形成胞嘧啶磺酸盐。然后,在液压脱氨,氨基从胞嘧啶磺酸生成尿嘧啶磺酸被去除。

为方便这些第一阶段的化学反应,DNA 制备层上覆有矿物油、 防止蒸发并有助于保持的焦亚硫酸钠含量。反应然后孵化在 55 ° C 在黑暗中。在此步骤中,代理以防止氧化等苯二酚,还会添加到该混合物。

若要收集 DNA 修饰含尿嘧啶磺酸和无矿物油,混合物离心和最低的液体层恢复。在此解决方案中的 DNA 进行纯化。

接下来,氢氧化钠被添加到 DNA 混合物,然后孵化在 37 ° c。这样做是为了诱导磺,其中 — — 你可能已经猜到了 — — 从尿嘧啶磺酸,形成尿嘧啶和完成化学反应中移除亚硫酸盐组。

最后,混合压制醋酸铵,加上和中收集 DNA,乙醇沉淀法。一旦已提纯的亚硫酸氢盐转换的 DNA,它被受到 PCR 和测序。

既然我们已经讨论了亚硫酸氢盐分析的基本方法,让我们看看一些实验的应用程序。

一些研究人员使用亚硫酸分析探讨基因组印记。在这里,研究人员越过拟南芥与遗传的差异,因此,产妇的两株和父系 DNA 可以加以区分。然后比较了由此产生的胚胎和关联的胚乳或支持胚胎组织中的甲基化模式。使用这种方法,科学家们发现 Cpg 中的孕产妇的等位基因的蛋白质编码基因,多边环境协定,倾向于但非甲基化在胚乳,胚中甲基化指示组织特异性印迹。

其他的研究者使用这技术来了解如何环境或社会因素可以改变甲基化模式。在这里,从他们的母亲来诱导应力,分离的鼠宝宝和他们的脑组织,随后分离。后测序的亚硫酸氢盐处理的 DNA,科学家决定在激素编码的基因, AVP,甲基化模式改变在大脑特定区域的"分离"的小狗,暗示长期生物效应的早期生活经历可能的分子机制。

最后,许多研究人员正试图优化亚硫酸分析以促进个人的独特的单元格之间的甲基化模式的比较。在这里,研究人员修改亚硫酸氢盐分析方法,以便对个别的小鼠卵母细胞在琼脂糖,有助于防止 DNA 丢失嵌入执行了所有步骤。使用此方法,研究者们能够很容易地识别通过寻找那些给多个甲基化模式,需要污染好与其他单元格的单卵母细胞样品。

你刚看了甲基化敏感分析朱庇特的视频。在这里,我们已经讨论了 DNA 甲基化在基因调控中的作用研究人员使用来标识在基因组、 亚硫酸氢盐分析广义的协议和最后,这种技术的一些应用甲基化的区域的方法。一如既往,感谢您收看 !

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