万士隆迁移实验

Cell Biology
 

Summary

在回应化学线索细胞迁移对发育、 免疫和疾病如癌症的国家至关重要。 为了量化细胞迁移,简单测定 1961 年由开发博士斯蒂芬 · 鲍,现在被称为万士隆迁移实验或博伊登室测定。这种安排包括插入把井多井板分成顶部和底部的隔间。到车厢顶部种子的细胞的迁移是有待研究的和趋化解决方案放在底舱。孵化后计数细胞在底舱允许迁移诱导趋化因子的量化。

这个视频会检讨细胞迁移实验的常用实验装置。然后我们会突出显示几个重要的考虑因素,并概述广义的协议运行实验涉及贴壁细胞。最后,我们会检讨目前被用来研究不同影响迁移的因素这个设置各种不同的搭配。

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JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 万士隆迁移实验. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

万士隆迁移实验是一种古典的技术,使得科学家能够量化细胞运动。迁移是指细胞的能力,单独或在集群中移动。细胞运动,使得通过精确重组其细胞骨架和迁移通常发生在充当线索的刺激反应。

今天,我们将讨论万士隆迁移实验,利用简单室安装程序,以评估在回应吸引线索迁移。

我们将首先对万士隆分庭提供一些背景信息。

首先,在 1961 年,用它来研究白细胞迁移由博士斯蒂芬 · 博伊登上设计了仪器。因此,这种方法也被称为是博伊登室测定。

在简单的 boyden 小室,外墙是井,96 孔板一样。里面每口井,以新生,这是一个圆柱形的插入,被放了。插入具有定义聚碳酸酯的膜孔径大小。当放到井里,它将分为两个隔间的分庭。车厢顶部是将种子的细胞的洄游行为是研究,底藏是放置趋化的解决方案。顾名思义,趋化因子是一种分子,有能力促进细胞运动由"吸引细胞"。

这些引力的作用,在车厢顶部细胞通过毛孔迁移到底藏。如果单元格像后运动一些黑色素瘤细胞的粘附性能,他们将"粘"在底部的膜。在这种情况下,可以固定膜,染色,并可以在显微镜下计数细胞。另一方面,非粘附细胞,像精子,将迁移到底藏。在这种情况下,储层解决方案中的单元格可以借助一个血球计数板计数。

虽然这种测定方法的设置很简单,有几件事情,你需要考虑在实验开始之前。让我们回顾一下他们。

从开始播种的解决方案,你必须确保优化的密度,以观察细胞迁移。太少的细胞可导致检测不到迁移,和更大的密度会过度繁殖膜,因此很难枚举迁移。第二个考虑是孔隙大小的插入。它应仔细选择取决于单元格的类型。如果孔径太小,细胞将无法通过。

或者,如果孔隙大小太大,细胞只会通过,而不是迁移。最后,必须同时顾及的趋化因子浓度和孵育时间允许进行迁移,因为这些都是相互依赖。与适当的孵育时间维持其浓度梯度运作之间,车厢的最佳浓度诱导化疗吸引力的细胞迁移。相反,长时间的孵化可能伴随平衡趋化整个分庭导致化学梯度,可以迷惑的分析得到的结果。

考虑到这些因素,让我们讨论一下用来衡量的贴壁细胞迁移的协议。

细胞进行分析准备中蛋白酶免费因为蛋白酶可以变性重要膜受体,并最终影响到迁移。细胞的准备完成后,暂停应被稀释到最优的播种密度。为了准备室,transwells 放在井多井板上。细胞悬浮液应吸取到万士隆没有触摸膜或引入的气泡。

趋化解决方案被吸取进了较低的水库,确保解决方案涉及的插入膜。迁移的孵化时间将取决于实验的注意事项。后孵化,由插入浸入 70%的乙醇固定膜。添加允许插入晾干后, 细胞染色液。

接下来,细胞孵育在室温约 30 分钟。后孵化,插入用洗涤缓冲帮助洗涤。最后,可以切除并放置显微镜的载物台上膜。膜的底面上的单元格代表有迁移中存在的细胞数目和趋化因子的缺乏。

以来,现在你已经为议定书 》 的感觉,让我们简要介绍一下研究人员如何在他们的探险中使用此方法。

这种测定方法最常见的应用之一是评价趋化属性未知化合物。在这里,科学家们感兴趣地审查游泳路径的青蛙精子在 allurin,这是一种由两栖类卵分泌的物质。要做到这一点,他们首先吸取积极青蛙精子到万士隆插入的顶部。他们添加到底部,allurin。让细胞迁移之后, 他们计数精子在显微镜下储层解决方案中。使用这种技术,他们得以生成浓度响应曲线描绘 allurin 浓度对精子迁移的影响。

当单元格被攻击的病原体时,它发出趋化因子招聘免疫细胞的迁移、 附加、 和随后解决感染。若要测试这种现象,这些科学家培养上皮细胞在底部的插入。随后,他们被感染的这些细胞与不同株细菌。最后,他们的免疫细胞引入为顶室了。众所周知的是,受感染的细胞产生诱导免疫细胞迁移的几种趋化因子。这次实验的结果表明不同程度的中性粒细胞迁移在应对不同类型的细菌感染。

最后,肿瘤细胞侵袭和转移通过细胞外基质总是吸引细胞生物学家。在这里,科学家们想要确定如何具体趋化因子,可以有助于通过 3D 矩阵这类迁移。他们转基因细胞的两个单独的池: 一个表达绿色荧光,和另一种红色荧光,蛋白质。然后,他们吸取到顶部的 transwells 胞外基质模仿。

一旦固化,他们倒万士隆和种子的细胞到膜的下方,两个泳池。接下来,他们更换成多井板插入并进入顶级室吸取趋化解决方案。这造成在底部向上和通过 3D 矩阵移动单元格。共焦成像的帮助下,这些研究人员重建 3d,细胞迁移和区分两组细胞的迁移模式。

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