二次元ゲル電気泳動

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

二次元ゲル電気泳動法 (2DGE) は、生体分子の混合物からの何千もの問題を解決できる手法です。この技法が一緒に結合されている 2 つの明瞭な分離法: 等電集中 (IEF) とナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)。これは物理的に彼らの等電点 (電気化学的特性) と、分子量でゲルの 2 つの軸にまたがる化合物を分離します。

このビデオでは手順は、2DGE と複雑なタンパク質溶液の組成を特徴付けるための一般的な手順の主な概念を説明します。病気の発生と進展、治療、次の翻訳後修飾 (PTM) 蛋白質の調査の監視のためのバイオ マーカー検出を含むアプリケーションのセクションでこの技術の 3 つの例のとおりです。

2 次元、または 2 D、ゲル電気泳動法は単一の混合物からたくさんの蛋白質を分離する 2 つの異なる分離法を用いる。1 つの技術の SDS-PAGE やナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動は完全に複雑な混合物だけを切り離すことはできません。第 2 ゲルの電気泳動に 2 番目メソッド、等電点焦点またはライセート セル可能性がありますすべての蛋白質の解決を可能にする分離は、等電点に基づく、IEF SDS ページのカップルします。このビデオは、2 D の原則のゲルの電気泳動、一般的な手順といくつかの生物医学応用の表示されます。

第 2 ゲルの電気泳動は、最初の次元として IEF で始まります。すべての蛋白質は、等電点または pI、純充満がゼロと呼ばれる pH 値を持ちます。タンパク質は電界に服従する、反対の電荷を持つ電極に向かって移動します。興味のサンプルは、ampholytes、酸性および基本的なグループを含んでいる分子が埋め込まれているストリップ固定化 pH 勾配または IPG に読み込まれます。電界がネット、その電荷を失う彼らの pI を一致する pH 値に到達するまで移行するタンパク質の原因 pH 勾配のストリップに適用されます。

2 番目の次元を実行、する前に埋め込まれた蛋白質は sds のそれらの変化と均一否定的な充電を提供して扱われます。完了すると、IPG ストリップ、ポリアクリルアミド ゲル上に配置されます。適用された電界は大きい蛋白質のゲルを通ってもっとゆっくり移動と陽極に向かって蛋白質を描画します。

蛋白質の混合物は、pI と分子量に従って分離されている、一度汚れを用いてプロテオーム マップを可視化、興味の蛋白質が識別されます。

第 2 ゲルの電気泳動の原理について説明した、代表的な検査法に行きましょう。

実験を実行する前に、蛋白質はメディアに可溶化する必要があります。サンプルの可溶化脱水素結合相互作用、タンパク質の電荷、ジスルフィド結合を破るに還元剤の変更を防ぐために非イオン性洗剤を混乱させるためカオトロ ピック剤の組み合わせでタンパク質を集約することによって達成され、バッファーします。遠心分離、および結果として得られるペレット; のコレクションによって、干渉の豊富なタンパク質や他の分子を削除するには、材料を順番に抽出します。エンドヌクレアーゼに実験を妨げる DNA を使用する酵素処理後。

タンパク質を可溶化されている、一度 IPG ストリップがストリップのクリーニング液と洗浄によって調製し、乾燥する逆さまのまま。各ストリップ ストリップ ホルダー番号を割り当てられます。一度準備ができて、細胞のエキスがプラスの末尾に負からゆっくりと、スライド モーションのストリップ上に読み込まれます。電極上に、ゲルのストリップの下に湿気のあぶらとり紙を配置水分補給の目的IPG ストリップし、IEF 楽器の上に並んでいます。高電流を適用し、タンパク質が移行し始めます。

最初の次元が完了した後、SDS ページのゲルは、鋳造装置で用意しています。IPG のストリップは、SDS 含んでいる平衡バッファーにダウン顔を置くことによって扱われます。電気泳動装置、電気泳動バッファーの追加準備します。治療の IPG ストリップは、ピンセット、ゲル板の上に置かれ、agarose シール ソリューションで封を使用して収集されます。電圧源は、電界、最速の移動蛋白質はゲルの底から 1 cm まで保持されますを適用します。

電気泳動の終了後、タンパク質を視覚化する必要があります。従来この Coomassie 青いや銀の硝酸塩との汚損によって実行されます。興味の蛋白質はゲルから転送、西部のしみの分析を行ったことがあります。

2 番目の識別方法には、質量分析法で分析するよりも、それらを消化、ゲルからタンパク質の切除が含まれます。

今では我々 は、手順を確認したところ、第 2 ゲルの電気泳動の使用方法のいくつかを見てみましょう。

この手法の最も一般的な用途の 1 つは病気の開始そして進行に関与する分子の同定です。質量分析とつながれる第 2 ゲルの電気泳動は、健康なものと比較して病変部の特定の蛋白質のアップまたはダウン規制を検出できます。

さらに、第 2 ゲルの電気泳動は、次の潜在的な薬物治療に対する患者の反応の進行に便利です。供試体は、様々 な縦長の治療投与の患者から取られるかもしれない。この方法で西部のしみまたは質量分析と相まって第 2 ゲルの電気泳動することができます炎症; などの否定的な反応に関連付けられているタンパク質を検出または緩和状態で蛋白質の不在。

第 2 ゲルの電気泳動の別の用途は、次の翻訳の mRNA から蛋白質への追加は、タンパク質の構造と機能、翻訳後修飾や PTM の研究です。PTM のさまざまなタンパク質シグナル伝達、遺伝子発現を含む機能を調節するなったり、酸化的損傷があります。第 2 ゲルの電気泳動は、メチル化やアセチル化、pI として分子量の変化を引き起こすことができるなどの変更に敏感です。

第 2 ゲルの電気泳動のゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、テクニック、典型的な実験、生物医学分野への応用のいくつかの原則を説明します。

見てくれてありがとう!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. 二次元ゲル電気泳動. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications