Zweidimensionale Gelelektrophorese

Biochemistry

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Summary

Zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DGE) ist eine Technik, die Tausende von Biomolekülen aus einer Mischung auflösen kann. Diese Technik beinhaltet zwei verschiedene Trennverfahren zusammen gekuppelt: isoelektrischen Fokussierung (IEF) und Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Dies trennt physikalisch Verbindungen über zwei Achsen eines Gels durch ihre isoelektrischen Punkte (eine elektrochemische Eigenschaft) und ihren Molekulargewichten.

Das Verfahren in diesem Video deckt die wichtigsten Konzepte der 2DGE und ein allgemeines Verfahren zur Charakterisierung der Zusammensetzung einer komplexen Proteinlösung. Drei Beispiele für diese Technik sind unter der Rubrik Anwendungen, einschließlich der Biomarker-Erkennung für Krankheit Initiierung und Fortschritt, Kontrollbehandlung bei Patienten und die Untersuchung von Proteinen nach posttranslationale Modifikation (PTM) gezeigt.

Zweidimensional, oder 2D, Gelelektrophorese ist eine Technik, die unter Verwendung zwei verschiedene Trennverfahren, die Tausenden von Proteinen aus einer einzigen Mischung trennen können. Eine der Techniken, SDS-PAGE oder Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, nicht vollständig allein komplexe Stoffgemische trennen. 2D Gelelektrophorese Paare der SDS-PAGE auf eine zweite Methode, isoelektrischen Fokussierung oder IEF, die trennt auf isoelektrischen Punkte, so dass für die Lösung von potenziell alle Proteine in einer Zelle lysate. Dieses Video zeigt, dass die Grundsätze der 2D gel-Elektrophorese, ein allgemeines Verfahren, und einige seiner biomedizinische Anwendungen.

2D Gelelektrophorese beginnt mit IEF als die erste Dimension. Jedes Protein hat einen pH-Wert, der isoelektrischen Punkt oder pI, genannt, wo die Nettoladung ist null. Wenn ein Protein in einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, bewegt sie in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung. Proben von Interesse sind immobilisierte pH-Gradienten oder IPG, Streifen verladen die Ampholyten, Moleküle mit saure und basische Gruppen eingegraben haben. Ein elektrisches Feld wird dann auf die pH Steigung Streifen, verursacht die Proteine zu migrieren, bis zum Erreichen des pH-Wertes Abgleich ihrer pI, wo sie verlieren ihre Nettoladung angewendet.

Vor dem Ausführen der zweiten Dimension, die eingebettete Proteine mit SDS, Denaturierung sie und bietet eine einheitliche negative Ladung behandelt. Einmal abgeschlossen, werden die IPG-Streifen auf einem Polyacrylamid-Gel platziert. Ein angewandter elektrisches Feld zieht die Proteine in Richtung der Anode mit größere Proteine langsam durch das Gel.

Sobald die Proteinmischung nach pI und Molekulargewicht abgetrennt wurde, die Proteom-Karte ist mit Flecken visualisiert und interessierender Proteine identifiziert.

Nun, da wir die Grundsätze der 2D Gelelektrophorese besprochen haben, gehen Sie wir über eine typische Laborverfahren.

Bevor das Experiment durchgeführt werden kann, müssen die Proteine in Medien solubilisiert. Solubilisierung der Probe erfolgt durch de-Aggregation Proteine mit einer Kombination von chaotropen Agenten für Störung der Wasserstoff-Bindung Interaktionen, nichtionische Detergentien, zu verhindern, ändern die Proteine kostenlos, Reduktionsmittel, Disulfid-Bindungen aufzubrechen und puffert. Um störende reichlich Proteinen und anderen Molekülen zu entfernen, wird das Material nacheinander durch Zentrifugation und Sammlung von der daraus resultierenden Pellet extrahiert; gefolgt von der Behandlung mit Endonuklease, ein Enzym verwendet, um keine DNA zu verbrauchen, die mit dem Experiment stören würde.

Sobald die Proteine solubilisiert haben, sind IPG Streifen durch das Ausspülen mit einem Streifen-Reinigungslösung vorbereitet und kopfüber trocknen gelassen. Jeder Streifen wird dann ein Streifen-Halter-Nummer zugewiesen. Einmal fertig, ist der Streifen in einer langsamen, gleitenden Bewegung vom negativ zum Pluspol der zelluläre Extrakt verladen. Zum Zwecke der Rehydratation wird feucht Löschpapier auf die Elektrode und unter die Gel-Streifen gelegt; die IPG-Streifen werden dann auf das IEF-Instrument gesäumt. Ein hoher elektrischer Strom angewendet, und die Proteine beginnen zu migrieren.

Nach Abschluss der ersten Dimension ist das Gel für SDS-PAGE in einer Gießvorrichtung bereit. Die IPG-Streifen werden behandelt werden, indem sie unten im SDS-haltigen Gleichgewichtherstellung Puffer. Die Elektrophorese-Einheit ist mit dem Zusatz von Elektrophorese Puffer vorbereitet. Die behandelten IPG-Streifen werden mit einer Pinzette, platziert die Gel-Platten und versiegelt mit Agarose-Abdichtung Lösung gesammelt. Eine Spannungsquelle gilt dann ein elektrisches Feld, das gehalten wird, bis die schnellste Bewegung Proteine 1 cm über dem Boden des Gels sind.

Nach Abschluss der Elektrophorese müssen die Proteine visualisiert werden. Traditionell erfolgt dies durch Färbung mit Coomassie-Blau oder Silber-Nitrat. Interessierenden Proteine werden durch Western-Blot Analyse aus dem Gel übertragen, und analysiert.

Ein zweiter Ansatz Identifikation beinhaltet Exzision der Proteine aus dem Gel, verdauen sie, als sie durch Massenspektrometrie analysiert.

Nun, da wir ein Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Anwendungen für 2D Gelelektrophorese.

Einer der häufigsten Verwendungszwecke für diese Technik ist die Identifizierung von Molekülen Krankheit Initiation und Progression beteiligt. 2D Gelelektrophorese, gekoppelt mit Massenspektrometrie, erkennt die Up oder Down-Regulierung spezifischer Proteine erkrankten Bereiche im Vergleich zu gesunden.

Darüber hinaus eignet sich die 2D Gelelektrophorese im Anschluss an der Fortschritts des Patienten als Reaktion auf eine mögliche therapeutische Droge. Patienten an verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung können Proben entnommen werden. Auf diese Weise können 2D Gelelektrophorese gepaart mit Western-Blot oder Massenspektrometrie Analyse Proteinen assoziiert mit negativen Reaktionen wie Entzündung erkennen; oder das Fehlen von Proteinen in einem gemilderten Zustand.

Ein weiteres Einsatzgebiet für 2D Gelelektrophorese ist die Untersuchung von Protein-Struktur und Funktion nach posttranslationale Modifikation oder PTM, die Ergänzungen zu den Proteinen, die nach ihrer Übersetzung von mRNA. PTM können eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Protein signaling, Genexpression regulieren oder oxidativen Schäden verursachen. 2D Gelelektrophorese reagiert empfindlich auf Veränderungen wie Methylierung oder Acetylierung, die eine Verschiebung in pI sowie das Molekulargewicht verursachen können.

Sie haben nur Jupiters Video auf 2D Gelelektrophorese angesehen. Dieses Video beschrieben die Prinzipien der Technik, eine typische Versuchsdurchführung und einige ihrer Anwendungen auf dem Gebiet der Biomedizin.

Danke fürs Zuschauen!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Zweidimensionale Gelelektrophorese. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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