酵素試金とカイネティクス

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

酵素反応速度論では、生物に必要な化学反応を促進する生体の酵素の触媒作用について説明します。フォーム製品の基板と呼ばれる分子に作用する酵素。酵素の速度論的パラメーターは直接または間接的に時間をかけて基板または製品の濃度の変化を測定するアッセイによって判別されます。

このビデオでは、酵素反応速度論 (レート方程式を含む) と運動モデルの基本原則をカバーします。酵素試金を支配する概念はまた、典型的な比色定量法に続いて議論します。アプリケーションの説明フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) 分析、環境では、細胞外酵素を特徴付けるを介して酵素免疫測定法と調査 DNA 修復速度分子プローブの使用します。

酵素は、生命に不可欠な生化学的触媒です。酵素試金は、酵素の触媒作用の解明、酵素反応の動力学的性質の研究に使用されます。このビデオは酵素反応速度論をカバーし、一般的な手順では、上に行くし、.いくつかのアプリケーションを表示

酵素は、蛋白質、または蛋白質のような分子を基板と呼ばれる反応物分子を対象とします。酵素は、生化学反応の活性化エネルギーを減らします。これにより、低エネルギーの要件と高速料金で発生する反応。

酵素反応は、3 つの基本コンポーネントに分けることができます。最初は、酵素-基質の形成酵素活性部位への基質の結合によって形成される複合体。複合体は、元の要素に分解できます。これは、2 番目の素の反応です。また、複雑な製品を形成し、酵素、3 番目の素反応を回復できます。

素反応の反応速度論は、基本レート法方程式によって与えられます。率法の方程式は、反応と速度定数の集積率を与えます。素反応のそれぞれは、独自の速度定数の個々 の料金法式を持ちます。これらの方程式は、ミカエリス-メンテン型方程式として知られているキネティック モデルまで蒸留することができます。これは、基質濃度の面での反応速度を与えることが実験的に決定します。ミカエリス-メンテン型方程式を用いた酵素反応のいくつかの一般的な傾向を識別できます。高基質濃度で飽和点に達すると、Vmax と呼ばれます。ここでは、率は全酵素濃度による制限は、製品に変換する酵素、基質分子の数あたりの時点、kcat として知られています。ミカエリス-メンテン型の速度論 kcat は反応速度を支配する 2 つの定数のいずれかです。その他の定数、KM は、親和性の定数と呼ばれます。KM は、反応速度が Vmax の半分に相当濃度と同じもです。高い親和性を持つ酵素が低い KM を持っているし、低い親和性をもつ酵素が高い KM を持っているし、Vmax に到達する時間がかかる中、高速 Vmax に達する。Kcat、KM を知って比較する酵素のことができます。これを行うには、酵素の効率と呼ばれる比率を使用します。高い kcat と低い KM 下 kcat ながら低い高い KM の結果の高い効率の結果します。

酵素反応速度論を解明するために使用する要素は、実験的に決定する必要があります。これらの試金は通常、制御された環境で酵素と基質ソリューションを混合することによって実行されます。観測は、基板、製品、または時間経過に伴って副生成物の濃度の変化を測定することによって作られています。

濃度の経年変化は、反応速度を決定するために使用されます。速度を決定するために複数の濃度で率データを取得する必要があります。占める割合バーク プロットとして知られている逆の初期濃度と逆の初期速度のプロットが直線の場合、反応はミカエリス-メンテン型の速度論に従います。斜面と直線の切片は、KM と Vmax は、kcat と酵素の効率を計算する使用できますの速度論的パラメーターの決定を許可します。

今では酵素反応速度論の原則を議論されている、典型的な酵素試金の実行方法を見てみましょう。

この手順では、比色定量法が示されています。最初のステップは、蛋白質濃度と吸光度を関連付ける標準的な曲線を生成します。濃度既知のソリューションは、コントロールのサンプルと一緒に用意しています。標的タンパク質と反応する開発者ソリューションは、着色された化合物を生成する追加されます。吸光度が測定し、標準曲線の生成を濃度に対してプロットします。

アッセイを実行するには、知られている基質濃度は酵素の適切な量と共に用意しています。酵素と基質は混合し、インキュベートする指定された時間間隔を許可しました。緩衝溶液と加熱ブロック pH と温度を管理します。焼入エージェントを追加して、反応を停止します。開発者ソリューションは反応に追加し、混合します。キュベットに配置されます、ソリューションと吸光度を測定します。基板の消費量は、標準曲線を測定した吸光度を比較することによって決まります。収集したデータを使用して、初期の反応速度は時間の経過と共に濃度をプロットすることによって決定されます。最後に、速度データと濃度、ミカエリス-メンテン型プロットが行われます。回転数と酵素の効率など酵素の動力学的性質の決定が可能になります。

今では試金プロシージャを確認しましたところ、その他さまざまな試金が実行されると、アプリケーションを見てみましょう。

この手順フレット分析を使用して蛋白質のペプチド結合を加水分解プロテアーゼの動力学を調査します。基板の消費と生産の継続的な定量分析を可能にする、反応速度の測定を支援、これらの排出量を測定できます。

酵素試金は、環境中の細胞外酵素活性レベルを決定する環境科学で使用できます。水、土壌、堆積物を環境から収集し、実験室で処理できます。これらの材料の細胞外の酵素活性は、酵素試金を使用して特徴付けることが。これは、環境が有機材料を処理する方法を理解するための便利なツールです。

細胞の DNA 修復機構は、核で見つかり酵素の速度論を研究することによって評価できます。ユニークな DNA シーケンスにバインドされたときのみ蛍光を発する蛍光の分子ビーコンを用いた DNA 損傷や損害、その酵素を削除します率が測定できます。レベルの DNA 修復は、蛍光に分類された胸の谷間製品を検出することにより、リアルタイムで測定できます。

酵素反応速度論とアッセイのゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ酵素反応速度論を説明した、分析概念について説明、一般的な手順を行って、いくつかのアプリケーションを説明しました。

見てくれてありがとう!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. 酵素試金とカイネティクス. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications