蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)

Biochemistry

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Summary

蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、近距離の生化学的な相互作用を調査するために使用する現象です。フレットのドナー蓄光分子非放射活性を転送できますエネルギー受容体分子にそれぞれ排出量と吸光度スペクトルが重なっている場合。転送されたエネルギーの量 — とサンプルの全体的な放出したがって — 蓄光分子のドナー-アクセプタ対の近さによって異なります。フレットの解析はこれから生体分子構造と相互作用の詳細な情報を取得するその他の生化学の手法を組み合わせて “ 分光ルーラー。 ”

このビデオの原則と FRET 解析の概念をカバー。手順は、フレットとの方法を提示し、データを解釈するためのサンプルの準備について説明します。最後に、セルまたは蛋白質、蛋白質の構造を変える酵素反応の監視の部分のラベル化による構造と細胞のプロセスを監視するアプリケーションが含まれます、セルによって表される単量体の集合を監視するフレットを使用します

発光分子間エネルギーの非放射伝達であり

蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレット、近距離の生化学的な相互作用を調査するために用いられます。フレットは 10 内蛍光分子の間隔が場合にのみ発生しますお互いの nm。フレットの分析は、詳細な構造情報を取得する他の手法と組み合わせることができます。このビデオがフレットの基本原則を紹介、プロトコルおよびデータのプレゼンテーションを要約し、いくつかの生化学的応用を議論

A 蓄光分子を蛍光体などの吸収スペクトルの波長の電磁波を吸収することによって興奮しています。それが緩和、その発光スペクトルの波長の光を出力します。蛍光の詳細については、参照してくださいゼウス ' s 蛍光顕微鏡ビデオ。異なる蛍光物質を吸収し、頻繁に重複する別の波長の光を発する。別蛍光体の吸収スペクトルと、蛍光体の発光スペクトルが大幅に重なっている場合、“ ドナー ” によって吸収される仮想光子をリリース、“ 受容体 ”。興奮してドナーがある 10 nm アクセプター、エネルギーのドナーからアクセプターに双極子-双極子相互作用によって転送されます。ドナーから光の放射によるエネルギーの放出はそれに応じて低下します。一方、興奮の受容体はその発光波長で発光します。フレットの応答は、効率、または蛍光または放射の他のプロセスではなくフレットによってドナーから放出されるエネルギーの割合の面で評価されます。効率は、ドナーとアクセプターとして機能するフレットを可能にする間の距離に強く依存する ' 分子 ' または ' 分光 ' ルーラー

生化学、フレット用いられる質的彼らは互いのフレット範囲外移動と fluorophores を監視することによって分子構造変化を観察します。同様に、フレットのペアを含む分子と細胞機能を学ぶことができます。ラベル付きの分子は酵素活性、フレット停止し観察される蛍光の波長変化によって切断されかどうか

フレットの背後にある原理を理解することができます ' プロトコルと提示し、データを解釈するいくつかの方法の概要を見て

前に実験、関心、DNA やタンパク質の生体蛍光タグで分子生物学手法修正を導入する一般的な方法を使用して工作。細胞に遺伝物質は、トランスフェクション、エレクトロポレーション

、セルが例えば蛍光顕微鏡でフレット可視化の準備、分子が 1 分子 FRET のスライドに固定化される可能性がありますまたはサンプルは、高スループット スクリーニングのための井戸に読み込まれます

、励起レーザー、顕微鏡および関連機器用意しています。(A) フレット実験は度々 強力なレーザー。(B) 適切な PPE と安全手順を使用する必要がありますサンプルは楽器に配置し励起レーザー点灯。

実験細胞の挙動を監視、カラー画像表示の違いまたは発光強度の変化は使用されます。ドナーとアクセプターの発光強度をプロット一緒に時間をかけてフレット応答を追跡するため

フレット データより複雑な分析のためのさまざまな機能に合うことができます。によって実験データが提示されて最高を表す複数の方法で柔軟な実験ツールをフレットを作る結果

今あなた ' 実行とフレット実験の分析の基礎を使い慣れてみましょう ' 生化学研究でフレットのいくつかのアプリケーションを見て

フレットは、タンパク質や細胞の 10 の内で移動すると予測の部分のラベル化による構造変化や細胞プロセスを研究するため使用ことができますフレット ペアでお互いの nm。たとえば、タンパク質センサーは、fluorophores のペアを持つ受容体の分類によって準備されます。フレットの応答は、共焦点顕微鏡によるライブ監視されます。発光波長と強度の変化を示す変化

フレットは、アクティブなフレットのペアを持つ分子の準備および応答の変化を観察することによっても使用できます。基板を切断すると、排出量ドナーとアクセプター発光の減少の増加を引き起こしてフレットが中断されます。排出量は、ドナー、アクセプタ、フレットによっての貢献を決定するために分析されます。シアンと黄色蛍光タンパク質の直接排出係数が計算されると、濃度と基板の速度論的パラメーターを決定できます

セルがフレットのペアは、その関数のいずれかを含むモノマーを表現する設計されて ' センサー ' これらの単量体間の相互作用のため。これらのモノマーの凝集を誘起すると、フレットの応答が観察されます。これを使用してによって引き起こされる蛋白質の集合を調査することができます ' シード ' タンパク質。セルされた名所抱卵し、フローサイトメトリーによる解析蛋白質の集合体増殖型、ここ

あなた ' ve を見たゼウス ' s 蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレットのビデオ。このビデオは、フレット、準備、フレットの実験、およびいくつかの生化学的アプリケーションの解析の基本原則を含まれている

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Cite this Video

JoVE Science Education Database. 生化学の必需品. 蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET). JoVE, Cambridge, MA, (2019).

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