蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)
English
Share
Overview
蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、近距離の生化学的な相互作用を調査するために使用する現象です。フレットのドナー蓄光分子非放射活性を転送できますエネルギー受容体分子にそれぞれ排出量と吸光度スペクトルが重なっている場合。転送されたエネルギーの量 — とサンプルの全体的な放出したがって — 蓄光分子のドナー-アクセプタ対の近さによって異なります。フレットの解析はこれから生体分子構造と相互作用の詳細な情報を取得するその他の生化学の手法を組み合わせて “ 分光ルーラー。 ”
このビデオの原則と FRET 解析の概念をカバー。手順は、フレットとの方法を提示し、データを解釈するためのサンプルの準備について説明します。最後に、セルまたは蛋白質、蛋白質の構造を変える酵素反応の監視の部分のラベル化による構造と細胞のプロセスを監視するアプリケーションが含まれます、セルによって表される単量体の集合を監視するフレットを使用します
。蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレット、近距離の生化学的な相互作用を調査するために用いられます。フレットは 10 内蛍光分子の間隔が場合にのみ発生しますお互いの nm。フレットの分析は、詳細な構造情報を取得する他の手法と組み合わせることができます。このビデオがフレットの基本原則を紹介、プロトコルおよびデータのプレゼンテーションを要約し、いくつかの生化学的応用を議論
。A 蓄光分子を蛍光体などの吸収スペクトルの波長の電磁波を吸収することによって興奮しています。それが緩和、その発光スペクトルの波長の光を出力します。蛍光の詳細については、参照してくださいゼウス ' s 蛍光顕微鏡ビデオ。異なる蛍光物質を吸収し、頻繁に重複する別の波長の光を発する。別蛍光体の吸収スペクトルと、蛍光体の発光スペクトルが大幅に重なっている場合、“ ドナー ” によって吸収される仮想光子をリリース、“ 受容体 ”。興奮してドナーがある 10 nm アクセプター、エネルギーのドナーからアクセプターに双極子-双極子相互作用によって転送されます。ドナーから光の放射によるエネルギーの放出はそれに応じて低下します。一方、興奮の受容体はその発光波長で発光します。フレットの応答は、効率、または蛍光または放射の他のプロセスではなくフレットによってドナーから放出されるエネルギーの割合の面で評価されます。効率は、ドナーとアクセプターとして機能するフレットを可能にする間の距離に強く依存する ' 分子 ' または ' 分光 ' ルーラー
。生化学、フレット用いられる質的彼らは互いのフレット範囲外移動と fluorophores を監視することによって分子構造変化を観察します。同様に、フレットのペアを含む分子と細胞機能を学ぶことができます。ラベル付きの分子は酵素活性、フレット停止し観察される蛍光の波長変化によって切断されかどうか
。フレットの背後にある原理を理解することができます ' プロトコルと提示し、データを解釈するいくつかの方法の概要を見て
。前に実験、関心、DNA やタンパク質の生体蛍光タグで分子生物学手法修正を導入する一般的な方法を使用して工作。細胞に遺伝物質は、トランスフェクション、エレクトロポレーション
。、セルが例えば蛍光顕微鏡でフレット可視化の準備、分子が 1 分子 FRET のスライドに固定化される可能性がありますまたはサンプルは、高スループット スクリーニングのための井戸に読み込まれます
。、励起レーザー、顕微鏡および関連機器用意しています。(A) フレット実験は度々 強力なレーザー。(B) 適切な PPE と安全手順を使用する必要がありますサンプルは楽器に配置し励起レーザー点灯。
。実験細胞の挙動を監視、カラー画像表示の違いまたは発光強度の変化は使用されます。ドナーとアクセプターの発光強度をプロット一緒に時間をかけてフレット応答を追跡するため
。フレット データより複雑な分析のためのさまざまな機能に合うことができます。によって実験データが提示されて最高を表す複数の方法で柔軟な実験ツールをフレットを作る結果
。今あなた ' 実行とフレット実験の分析の基礎を使い慣れてみましょう ' 生化学研究でフレットのいくつかのアプリケーションを見て
。フレットは、タンパク質や細胞の 10 の内で移動すると予測の部分のラベル化による構造変化や細胞プロセスを研究するため使用ことができますフレット ペアでお互いの nm。たとえば、タンパク質センサーは、fluorophores のペアを持つ受容体の分類によって準備されます。フレットの応答は、共焦点顕微鏡によるライブ監視されます。発光波長と強度の変化を示す変化
。フレットは、アクティブなフレットのペアを持つ分子の準備および応答の変化を観察することによっても使用できます。基板を切断すると、排出量ドナーとアクセプター発光の減少の増加を引き起こしてフレットが中断されます。排出量は、ドナー、アクセプタ、フレットによっての貢献を決定するために分析されます。シアンと黄色蛍光タンパク質の直接排出係数が計算されると、濃度と基板の速度論的パラメーターを決定できます
。セルがフレットのペアは、その関数のいずれかを含むモノマーを表現する設計されて ' センサー ' これらの単量体間の相互作用のため。これらのモノマーの凝集を誘起すると、フレットの応答が観察されます。これを使用してによって引き起こされる蛋白質の集合を調査することができます ' シード ' タンパク質。セルされた名所抱卵し、フローサイトメトリーによる解析蛋白質の集合体増殖型、ここ
。あなた ' ve を見たゼウス ' s 蛍光共鳴エネルギー移動、またはフレットのビデオ。このビデオは、フレット、準備、フレットの実験、およびいくつかの生化学的アプリケーションの解析の基本原則を含まれている
。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.
A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.
In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.
Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.
Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.
Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.
Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.
For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.
FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.
Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.
FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.
FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.
Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.
You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.
Thanks for watching!
