Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)
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Overview
Transferencia de la energía de Förster Resonancia (FRET) es un fenómeno para investigar interacciones bioquímicas de la cerrar-gama. En el traste, una molécula fotoluminiscente de donantes no radiativamente puede transferir energía a una molécula aceptora si se superponen sus respectivos espectros de emisión y absorción. La cantidad de energía transferida — y, en consecuencia, la emisión total de la muestra — depende de la proximidad de un par de donantes aceptador de moléculas fotoluminiscentes. Análisis de traste se combinación con otras técnicas de bioquímica para obtener información detallada de las estructuras biomoleculares y las interacciones de esta “ regla espectroscópica. ”
este video cubre los principios y conceptos de análisis de traste. El procedimiento se centra en la preparación de muestras para el traste y formas presentar e interpretar datos. Por último, las aplicaciones incluyen el seguimiento a los procesos celulares y conformacionales por etiquetar las partes de una célula o proteína, control de reacciones enzimáticas que alteran estructuras de la proteína, y utilizando FRET para controlar la agregación de los monómeros expresados por las células de.
Förster transferencia de energía de resonancia o traste, es una transferencia no radiativo de energía entre las moléculas que emiten luz y a menudo se utiliza para investigar las interacciones bioquímicas de la cerrar-gama. TRASTE sólo se produce cuando las moléculas fluorescentes están espaciadas dentro de los 10 nm de cada uno. Análisis de traste pueden combinarse con otras técnicas para obtener información estructural detallada. Este video se introducir los principios subyacentes del traste, resumir una presentación protocolo y datos y discutir algunas aplicaciones bioquímicas.
molécula de fotoluminiscente de A como un fluoróforo es excitada mediante la absorción de radiación electromagnética en una longitud de onda en su espectro de absorción. Como se relaja, emite luz en una longitud de onda en su espectro de emisión. Para obtener más información acerca de la fluorescencia, vea Zeus ' s video en microscopía de fluorescencia. Fluoróforos diferentes absorben y emiten luz a diferentes longitudes de onda, que con frecuencia se superponen. Si el espectro de emisión de un fluoróforo se traslapa considerablemente con el espectro de absorción de otro fluoróforo, la “ donante ” lanzará un fotón virtual, que es absorbido por el “ aceptor ”. Cuando un donador excitado está dentro de los 10 nm de un aceptor, energía transfiere del donante al aceptor interacciones dipolo-dipolo. Consecuencia disminuye la liberación de energía por la emisión de la luz de la donante. Mientras tanto, el aceptador excitado emite luz en su longitud de onda de emisión. La respuesta de traste se evalúa en términos de eficiencia o el porcentaje de energía liberada de la donante por traste en lugar de fluorescencia u otros procesos radiativos. La eficiencia depende fuertemente de la distancia entre el donante y receptor, que permite el traste al actuar como un ' molecular ' o ' espectroscópica ' regla.
En Bioquímica, traste se utiliza a menudo cualitativo para observar los cambios conformacionales de moléculas mediante el control de fluoróforos mientras se mueven dentro y fuera de la gama del traste uno del otro. Del mismo modo, las funciones celulares pueden estudiarse con moléculas que contienen un par de trastes. Si la molécula marcada es dividida por actividad enzimática, traste paradas y los cambios de longitud de onda de fluorescencia observada.
Ahora que usted entiende los principios del traste, ' s, mira en una descripción de un protocolo y unas maneras para presentar e interpretar los datos.
el experimento, las biomoléculas de interés, normalmente ADN o proteínas, están diseñados con las etiquetas fluorescentes, utilizando técnicas de biología molecular. formas comunes de introducir modificado material genético en las células incluyen transfección y electroporación.
Entonces, las células se preparan para traste visualización en un microscopio de fluorescencia por ejemplo, las moléculas se pueden inmovilizadas en una diapositiva para el traste de una sola molécula o las muestras se cargan en pozos para el cribado de alto rendimiento.
Entonces, los láseres de excitación, microscopio y equipos asociados están preparados. (A) traste experimentos implican a menudo lasers de gran alcance; (B) tan apropiado PPE y procedimientos de seguridad deben utilizarse. la muestra entonces se coloca en el instrumento e iluminada con el láser de excitación.
para experimentos de monitoreo de comportamiento de la célula, color imágenes mostrando diferencias o cambios en la intensidad de emisión se utilizan. Intensidades de emisión de donador y aceptor se trazan para seguimiento de respuesta de traste en el tiempo.
Traste datos pueden también montarse en diversas funciones para análisis más complejos. Según el experimento, los datos se pueden presentar de múltiples maneras de representar mejor los resultados, haciendo una flexible herramienta experimental del traste.
ahora que te ' re familiarizados con los conceptos básicos de funcionamiento y analizar un experimento de traste, que ' s ver algunas aplicaciones de FRET en investigación bioquímica.
TRASTE depuede utilizarse para estudiar los cambios conformacionales o procesos celulares por etiquetado de piezas de la proteína o célula predicho para moverse dentro de los 10 nm entre sí con un par de trastes. Por ejemplo, sensores de proteína se preparan etiquetado receptores con un par de fluoróforos. La respuesta de traste se controla directo por microscopia confocal. Variación de la intensidad y longitud de onda de emisión indicar cambios conformacionales.
TRASTE depuede utilizarse también preparar moléculas con un par de trastes activo y observando cambios en la respuesta. Cuando el sustrato es dividido, traste es perturbado, causando un aumento en la emisión de donantes y una disminución en la emisión del aceptador. Las emisiones se analizan para determinar las contribuciones por donante, receptor y traste. Una vez que se calculan los factores de emisión directa de las proteínas fluorescentes cian y amarillo, se pueden determinar la concentración y los parámetros cinéticos del sustrato.
Células diseñadas para expresar monómeros que contenga cualquiera de una función par de trastes ' sensores de ' para las interacciones entre los monómeros. Si se induce la agregación de los monómeros, se observa una respuesta de traste. Esto puede usarse para investigar la agregación de proteínas provocada por ' siembra ' de proteínas mal plegadas. Aquí, las células fueron transduced con agregados de la proteína de interés, se incubó y analizaron mediante citometría de flujo.
te ' ve a Miró JoVE ' s video en transferencia de energía de resonancia Förster o traste. Este video contiene los principios subyacentes del traste, preparación y análisis de un experimento de traste y unas cuantas aplicaciones bioquímicas.
Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
Transcript
Förster Resonance Energy Transfer, or FRET, is a non-radiative transfer of energy between light-emitting molecules, and is often used to investigate close-range biochemical interactions. FRET only occurs when fluorescent molecules are spaced within 10 nm of each other. FRET analysis can be combined with other techniques to obtain detailed structural information. This video will introduce the underlying principles of FRET, summarize a protocol and data presentation, and discuss some biochemical applications.
A photoluminescent molecule such as a fluorophore is excited by absorbing electromagnetic radiation at a wavelength in its absorption spectrum. As it relaxes, it emits light at a wavelength within its emission spectrum. For more information about fluorescence, see JoVE’s video on fluorescence microscopy. Different fluorophores absorb and emit light at different wavelengths, which frequently overlap. If the emission spectrum of a fluorophore overlaps significantly with the absorption spectrum of another fluorophore, the “donor” will release a virtual photon, which is absorbed by the “acceptor”. When an excited donor is within 10 nm of an acceptor, energy is transferred from donor to acceptor by dipole-dipole interactions. The release of energy by emission of light from the donor correspondingly decreases. Meanwhile, the excited acceptor emits light at its emission wavelength. The FRET response is evaluated in terms of efficiency, or the percentage of energy released from the donor by FRET rather than by fluorescence or other radiative processes. The efficiency depends strongly on the distance between the donor and acceptor, which allows FRET to act as a ‘molecular’ or ‘spectroscopic’ ruler.
In biochemistry, FRET is often used qualitatively to observe conformational changes in molecules by monitoring fluorophores as they move in and out of FRET range of each other. Similarly, cellular functions can be studied with molecules containing a FRET pair. If the labeled molecule is cleaved by enzyme activity, FRET stops and the observed fluorescence wavelength changes.
Now that you understand the principles behind FRET, let’s look at an overview of a protocol and a few ways to present and interpret the data.
Prior to the experiment, the biomolecules of interest, typically DNA or proteins, are engineered with fluorescent tags, using molecular biology techniques. Common ways to introduce the modified genetic material into the cells include transfection and electroporation.
Then, the cells are prepared for FRET visualization on a fluorescence microscope. For instance, the molecules may be immobilized on a slide for single-molecule FRET, or samples are loaded into wells for high-throughput screening.
Then, the excitation lasers, microscope, and associated equipment are prepared. (A) FRET experiments often involve powerful lasers; (B) so appropriate PPE and safety procedures should be used. The sample is then placed in the instrument and illuminated with the excitation laser.
For experiments monitoring cell behavior, color images showing differences or changes in emission intensity are used. Donor and acceptor emission intensities are plotted together to track FRET response over time.
FRET data can also be fitted to various functions for more complex analyses. Depending on the experiment, data may be presented in multiple ways to best represent the results, making FRET a flexible experimental tool.
Now that you’re familiar with the basics of running and analyzing a FRET experiment, let’s look at some applications of FRET in biochemistry research.
FRET can be used to study conformational changes or cellular processes by labeling parts of the protein or cell predicted to move within 10 nm of each other with a FRET pair. For example, protein sensors are prepared by labeling receptors with a pair of fluorophores. The FRET response is monitored live by confocal microscopy. Variation of emission wavelength and intensity indicate conformational changes.
FRET can also be used by preparing molecules with an active FRET pair and observing changes in the response. When the substrate is cleaved, FRET is disrupted, causing an increase in donor emission and a decrease in acceptor emission. The emissions are analyzed to determine contributions by donor, acceptor, and FRET. Once the direct emission factors are calculated for the cyan and yellow fluorescent proteins, the concentration and kinetic parameters of the substrate can be determined.
Cells designed to express monomers containing either of a FRET pair function as ‘sensors’ for interactions between those monomers. If aggregation of those monomers is induced, a FRET response is observed. This can be used to investigate protein aggregation triggered by ‘seeding’ of misfolded proteins. Here, cells were transduced with aggregates of the protein of interest, incubated, and analyzed with flow cytometry.
You’ve just watched JoVE’s video on Förster Resonance Energy Transfer, or FRET. This video contained the underlying principles of FRET, preparation and analysis of a FRET experiment, and a few biochemical applications.
Thanks for watching!
