Overview
העברת אנרגיית תהודה Förster (FRET) היא תופעה המשמשת לחקר אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. ב- FRET, מולקולת פוטולומינסנט תורם יכולה להעביר אנרגיה באופן לא רדיקטיבי למולקולת קבלה אם ספקטרום הפליטה והספיגה שלהם חופפים. כמות האנרגיה המועברת – וכתוצאה מכך הפליטה הכוללת של המדגם – תלויה בקרבת זוג מולקולות פוטו-לומינסנט של מקבל-תורם. ניתוח FRET משולב עם טכניקות ביוכימיה אחרות כדי לקבל מידע מפורט של מבנים ביומולקולריים ואינטראקציות מ"סרגל ספקטרוסקופי "זה.
וידאו זה מכסה את העקרונות והמושגים של ניתוח FRET. ההליך מתמקד בהכנת דוגמאות עבור FRET ודרכים להציג ולפרש נתונים. לבסוף, היישומים כוללים ניטור תהליכים קונפורמיים ותאיים על ידי תיוג חלקים של תא או חלבון, ניטור תגובות אנזימים שמשנות מבני חלבון, ושימוש ב- FRET לניטור צבירה של מונומרים המובעים על ידי תאים.
Förster תהודה העברת אנרגיה, או FRET, הוא העברה לא מקרינה של אנרגיה בין מולקולות פולטת אור, והוא משמש לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. FRET מתרחשת רק כאשר מולקולות פלואורסצנטיות מרווחות בתוך 10 ננומטר זו מזו. ניתוח FRET ניתן לשלב עם טכניקות אחרות כדי לקבל מידע מבני מפורט. וידאו זה יציג את העקרונות הבסיסיים של FRET, יסכם פרוטוקול ומצגת נתונים, וידון בכמה יישומים ביוכימיים.
מולקולה פוטולומינסנטית כמו פלואורופור מתרגשת מספיגת קרינה אלקטרומגנטית אורך גל בספקטרום הקליטה שלה. כשהוא נרגע, הוא פולט אור אורך גל בתוך ספקטרום הפליטה שלו. למידע נוסף על פלואורסצנטיות, ראו סרטון של JoVE על מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. פלואורופורים שונים סופגים ולפוטים אור באורכי גל שונים, אשר חופפים לעתים קרובות. אם ספקטרום הפליטה של פלואורופור חופף באופן משמעותי עם ספקטרום הספיגה של פלואורופור אחר, "התורם" ישחרר פוטון וירטואלי, אשר נספג על ידי "מקבל". כאשר תורם נרגש נמצא בטווח של 10 ננומטר של מקבל, אנרגיה מועברת מתורם לקבל על ידי אינטראקציות דיפול-דיפול. שחרור האנרגיה על ידי פליטת אור מהתורם בהתאמה פוחתת. בינתיים, המקבל הנרגש פולט אור אורך גל הפליטה שלו. תגובת FRET מוערכת במונחים של יעילות, או אחוז האנרגיה ששוחררה מהתורם על ידי FRET ולא על ידי פלואורסצנטיות או תהליכים רדיאטוריים אחרים. היעילות תלויה מאוד במרחק בין התורם לבין המקבל, המאפשר FRET לפעול כשליט 'מולקולרי' או 'ספקטרוסקופי'.
בביוכימיה, FRET משמש לעתים קרובות באופן איכותי כדי לבחון שינויים קונפורמציה במולקולות על ידי ניטור פלואורופורים כשהם נעים פנימה והחוצה של טווח FRET אחד של השני. באופן דומה, ניתן ללמוד פונקציות תאיות עם מולקולות המכילות זוג FRET. אם המולקולה המסומנת מכווצת בפעילות אנזימים, FRET מפסיק ואורך הגל הנצפה של פלואורסצנטיות משתנה.
כעת, כאשר אתם מבינים את העקרונות שמאחורי FRET, בואו נסתכל על סקירה כללית של פרוטוקול וכמה דרכים להציג ולפרש את הנתונים.
לפני הניסוי, הביומולקולות של עניין, בדרך כלל DNA או חלבונים, מהונדסים עם תגי פלורסנט, באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית. דרכים נפוצות להכניס את החומר הגנטי שונה לתוך התאים כוללים transfection ואלקטרופורציה.
לאחר מכן, התאים מוכנים להדמיה FRET על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, המולקולות עשויות להיות משותקות בשקופית עבור FRET של מולקולה אחת, או שדגימות נטענות לבארות להקרנת תפוקה גבוהה.
לאחר מכן, לייזרי העירור, המיקרוסקופ והציוד הנלווה מוכנים. (א) ניסויי FRET כרוכים לעתים קרובות לייזרים חזקים; (ב) יש להשתמש ב- PPE ובהליכי בטיחות מתאימים. לאחר מכן המדגם ממוקם בכלי ומואר בלייזר העירור.
לניסויים המנטרים את התנהגות התאים, נעשה שימוש בתמונות צבע המציגות הבדלים או שינויים בעוצמת הפליטה. עוצמות פליטת התורמים והמקבלים זוממות יחד כדי לעקוב אחר תגובת FRET לאורך זמן.
ניתן גם להתאים נתוני FRET לפונקציות שונות עבור ניתוחים מורכבים יותר. בהתאם לניסוי, הנתונים עשויים להיות מוצגים בדרכים מרובות כדי לייצג בצורה הטובה ביותר את התוצאות, מה שהופך את FRET לכלי ניסיוני גמיש.
עכשיו שאתם מכירים את היסודות של ריצה וניתוח ניסוי FRET, בואו נסתכל על כמה יישומים של FRET במחקר ביוכימיה.
FRET יכול לשמש כדי ללמוד שינויים קונפורמציה או תהליכים תאיים על ידי תיוג חלקים של החלבון או התא צפוי לנוע בתוך 10 ננומטר אחד של השני עם זוג FRET. לדוגמה, חיישני חלבון מוכנים על ידי תיוג קולטנים עם זוג פלואורופורים. תגובת FRET מנוטרת בשידור חי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. וריאציה של אורך גל פליטה ועוצמת מצביעה על שינויים קונפורמציה.
FRET יכול לשמש גם על ידי הכנת מולקולות עם זוג FRET פעיל התבוננות בשינויים בתגובה. כאשר המצע מבקע, FRET מופרע, מה שגורם לעלייה בפליטת התורמים ולירידה בפליטת מקבל. הפליטות מנותחות כדי לקבוע תרומות על ידי תורם, מקבל ו FRET. לאחר גורמי הפליטה הישירים מחושבים עבור חלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב, ניתן לקבוע את הריכוז ואת הפרמטרים הקינטיים של המצע.
תאים שנועדו לבטא מונומרים המכילים אחד מצמד FRET מתפקדים כ'חיישנים ' לאינטראקציות בין אותם מונומרים. אם צבירה של מונומרים אלה מושרה, תגובת FRET הוא ציין. זה יכול לשמש כדי לחקור צבירה חלבון מופעלת על ידי 'זריעה' של חלבונים misfolded. כאן, תאים הועברו עם אגרגטים של חלבון של עניין, דגירה, וניתח עם ציטומטריית זרימה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על העברת אנרגיה תהודה של פורסטר, או FRET. וידאו זה הכיל את העקרונות הבסיסיים של FRET, הכנה וניתוח של ניסוי FRET, וכמה יישומים ביוכימיים.
תודה שצפיתם!
Procedure
העברת אנרגיית תהודה Förster (FRET) היא תופעה המשמשת לחקר אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. ב- FRET, מולקולת פוטולומינסנט תורם יכולה להעביר אנרגיה באופן לא רדיקטיבי למולקולת קבלה אם ספקטרום הפליטה והספיגה שלהם חופפים. כמות האנרגיה המועברת – וכתוצאה מכך הפליטה הכוללת של המדגם – תלויה בקרבת זוג מולקולות פוטו-לומינסנט של מקבל-תורם. ניתוח FRET משולב עם טכניקות ביוכימיה אחרות כדי לקבל מידע מפורט של מבנים ביומולקולריים ואינטראקציות מ"סרגל ספקטרוסקופי "זה.
וידאו זה מכסה את העקרונות והמושגים של ניתוח FRET. ההליך מתמקד בהכנת דוגמאות עבור FRET ודרכים להציג ולפרש נתונים. לבסוף, היישומים כוללים ניטור תהליכים קונפורמיים ותאיים על ידי תיוג חלקים של תא או חלבון, ניטור תגובות אנזימים שמשנות מבני חלבון, ושימוש ב- FRET לניטור צבירה של מונומרים המובעים על ידי תאים.
Förster תהודה העברת אנרגיה, או FRET, הוא העברה לא מקרינה של אנרגיה בין מולקולות פולטת אור, והוא משמש לעתים קרובות כדי לחקור אינטראקציות ביוכימיות לטווח קרוב. FRET מתרחשת רק כאשר מולקולות פלואורסצנטיות מרווחות בתוך 10 ננומטר זו מזו. ניתוח FRET ניתן לשלב עם טכניקות אחרות כדי לקבל מידע מבני מפורט. וידאו זה יציג את העקרונות הבסיסיים של FRET, יסכם פרוטוקול ומצגת נתונים, וידון בכמה יישומים ביוכימיים.
מולקולה פוטולומינסנטית כמו פלואורופור מתרגשת מספיגת קרינה אלקטרומגנטית אורך גל בספקטרום הקליטה שלה. כשהוא נרגע, הוא פולט אור אורך גל בתוך ספקטרום הפליטה שלו. למידע נוסף על פלואורסצנטיות, ראו סרטון של JoVE על מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. פלואורופורים שונים סופגים ולפוטים אור באורכי גל שונים, אשר חופפים לעתים קרובות. אם ספקטרום הפליטה של פלואורופור חופף באופן משמעותי עם ספקטרום הספיגה של פלואורופור אחר, "התורם" ישחרר פוטון וירטואלי, אשר נספג על ידי "מקבל". כאשר תורם נרגש נמצא בטווח של 10 ננומטר של מקבל, אנרגיה מועברת מתורם לקבל על ידי אינטראקציות דיפול-דיפול. שחרור האנרגיה על ידי פליטת אור מהתורם בהתאמה פוחתת. בינתיים, המקבל הנרגש פולט אור אורך גל הפליטה שלו. תגובת FRET מוערכת במונחים של יעילות, או אחוז האנרגיה ששוחררה מהתורם על ידי FRET ולא על ידי פלואורסצנטיות או תהליכים רדיאטוריים אחרים. היעילות תלויה מאוד במרחק בין התורם לבין המקבל, המאפשר FRET לפעול כשליט 'מולקולרי' או 'ספקטרוסקופי'.
בביוכימיה, FRET משמש לעתים קרובות באופן איכותי כדי לבחון שינויים קונפורמציה במולקולות על ידי ניטור פלואורופורים כשהם נעים פנימה והחוצה של טווח FRET אחד של השני. באופן דומה, ניתן ללמוד פונקציות תאיות עם מולקולות המכילות זוג FRET. אם המולקולה המסומנת מכווצת בפעילות אנזימים, FRET מפסיק ואורך הגל הנצפה של פלואורסצנטיות משתנה.
כעת, כאשר אתם מבינים את העקרונות שמאחורי FRET, בואו נסתכל על סקירה כללית של פרוטוקול וכמה דרכים להציג ולפרש את הנתונים.
לפני הניסוי, הביומולקולות של עניין, בדרך כלל DNA או חלבונים, מהונדסים עם תגי פלורסנט, באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית. דרכים נפוצות להכניס את החומר הגנטי שונה לתוך התאים כוללים transfection ואלקטרופורציה.
לאחר מכן, התאים מוכנים להדמיה FRET על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לדוגמה, המולקולות עשויות להיות משותקות בשקופית עבור FRET של מולקולה אחת, או שדגימות נטענות לבארות להקרנת תפוקה גבוהה.
לאחר מכן, לייזרי העירור, המיקרוסקופ והציוד הנלווה מוכנים. (א) ניסויי FRET כרוכים לעתים קרובות לייזרים חזקים; (ב) יש להשתמש ב- PPE ובהליכי בטיחות מתאימים. לאחר מכן המדגם ממוקם בכלי ומואר בלייזר העירור.
לניסויים המנטרים את התנהגות התאים, נעשה שימוש בתמונות צבע המציגות הבדלים או שינויים בעוצמת הפליטה. עוצמות פליטת התורמים והמקבלים זוממות יחד כדי לעקוב אחר תגובת FRET לאורך זמן.
ניתן גם להתאים נתוני FRET לפונקציות שונות עבור ניתוחים מורכבים יותר. בהתאם לניסוי, הנתונים עשויים להיות מוצגים בדרכים מרובות כדי לייצג בצורה הטובה ביותר את התוצאות, מה שהופך את FRET לכלי ניסיוני גמיש.
עכשיו שאתם מכירים את היסודות של ריצה וניתוח ניסוי FRET, בואו נסתכל על כמה יישומים של FRET במחקר ביוכימיה.
FRET יכול לשמש כדי ללמוד שינויים קונפורמציה או תהליכים תאיים על ידי תיוג חלקים של החלבון או התא צפוי לנוע בתוך 10 ננומטר אחד של השני עם זוג FRET. לדוגמה, חיישני חלבון מוכנים על ידי תיוג קולטנים עם זוג פלואורופורים. תגובת FRET מנוטרת בשידור חי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. וריאציה של אורך גל פליטה ועוצמת מצביעה על שינויים קונפורמציה.
FRET יכול לשמש גם על ידי הכנת מולקולות עם זוג FRET פעיל התבוננות בשינויים בתגובה. כאשר המצע מבקע, FRET מופרע, מה שגורם לעלייה בפליטת התורמים ולירידה בפליטת מקבל. הפליטות מנותחות כדי לקבוע תרומות על ידי תורם, מקבל ו FRET. לאחר גורמי הפליטה הישירים מחושבים עבור חלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב, ניתן לקבוע את הריכוז ואת הפרמטרים הקינטיים של המצע.
תאים שנועדו לבטא מונומרים המכילים אחד מצמד FRET מתפקדים כ'חיישנים ' לאינטראקציות בין אותם מונומרים. אם צבירה של מונומרים אלה מושרה, תגובת FRET הוא ציין. זה יכול לשמש כדי לחקור צבירה חלבון מופעלת על ידי 'זריעה' של חלבונים misfolded. כאן, תאים הועברו עם אגרגטים של חלבון של עניין, דגירה, וניתח עם ציטומטריית זרימה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על העברת אנרגיה תהודה של פורסטר, או FRET. וידאו זה הכיל את העקרונות הבסיסיים של FRET, הכנה וניתוח של ניסוי FRET, וכמה יישומים ביוכימיים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
