Biology

대량 연안 해수 샘플 (20L +) 여과

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

물 칼럼에서 0.22μm와 직경 2.7μm 사이의 범위 미생물 바이오 매스의이 동영상은 문서 대형 볼륨 (≥ 20 L) 여과,.

Abstract

흐름은 하류 미생물 커뮤니티 해안 해양 물, 영양 및 추적 가스 분석의 수집과 함께 시작됩니다. 이 방법의 경우, 샘플은 사니치 후미에 HMS 존 스트 리클 랜드 운영의 갑판에서 수집되었다. 물 칼럼에서 0.22μm와 직경 2.7μm 사이의 범위 미생물 바이오 매스의이 동영상은 문서 대형 볼륨 (≥ 20 L) 여과,. 두 20L 샘플은 네 머리 회전을 갖춘 단일 펌프 장치를 사용하여 동시에 필터링할 수 있습니다. 여과 연장 여행 분야에서 일을하거나, 즉시 당일 여행 돌아오면됩니다. 각 sterivex 필터 유닛 통과 물의 양을 기록하는 것이 중요합니다. 샘플링 여행 사이의 biofilm 형성을 방지하기 위해, 모든 여과 장비는 희석 HCL 및 탈이온수로 씻어서 바로 사용 후 autoclaved해야합니다. 이 절차는 약 5 시간 플러스 치우기 추가 시간이 소요됩니다.

Protocol

여과 장치의 설정
1. 여과 장치를 설정하려면, prefilter 주택 단위로 등급 GF / D 필터를 배치 핀셋을 사용합니다. 대충 손으로 주택을 조입니다. 엄지의 규칙으로, 오버 강화하지 않거나 장치의 펌핑 시작되면 누출됩니다.
2. 조심스럽게 그것을 만지지 않고 상자 속에 든 대형 유리병에 내부 튜브를 삽입하여 autoclaved 뚜껑과 연결된 튜브로 상자 속에 든 대형 유리병 뚜껑을 교체합니다. 필요한 경우, 상자 속에 든 대형 유리병에 튜브를 안내 핀셋을 사용합니다.
3. 연동 펌프를 통해 외부 튜빙을 전달합니다.
4. 모두 외부 튜브 (상자 속에 든 대형 유리병 당 즉 2 대)의 끝 부분에 prefilter 주택 장치를 연결합니다. 펜치와 연결을 조인다.
해수 여과
1. 해수를 필터링 시작하려면 펌프의 전원을 켜고 1 흐름 속도를 설정할 수 있습니다. 물이가 올바른 방향으로 나오지되도록보세요.
2. 물 500 ML은 prefilter 단위 통해 1 L의 비커에 자유롭게 흘러 수 있습니다.
3. 펌프를 끄고, 그리고 prefilter 설정의 자유로운 끝에 남자 luer 피팅에 Sterivex 필터를 첨부합니다. 손으로 prefilter 주택 snugly를 조이십시오.
4. prefilter 주택에서와 prefilter 주택 상자 속에 든 대형 유리병에 이르게 튜브 사이의 연결에서 살펴보십시오. 누수가 발생하면 펌프를 끄고 느슨하게하고 그에 따라 prefilter 주택을 retighten. 뒷면에있는 펌프를 켭니다.
5. 4 L의 flasks에 여과물를 수집합니다. 일단 그들은 깨끗한 상자 속에 든 대형 유리병에 flasks가 비어 가득 찼습니다. 각 필터를 통해 전달되는 볼륨을 참고하시기 바랍니다. 수집 여과액는 바이러스에 대한 여과 등 추가로 처리할 수 있습니다.
6. 물도이 carboys 달았어 때까지 계속 필터링. 4-5 H / 20 L의 상자 속에 든 대형 유리병 사이의 일반적인 여과 시간 범위는 있지만, 이것은 물 내에서 바이오 매스의 양을에 크게 의존합니다.
7. 여과가 완료되면 펌프를 끄고 Sterivex 필터를 분리합니다.
필터 저장
1. 필터를 저장하려면 먼저 30-60 ML의 주사기와 함께 남아있는 물을 추방.
2. 피펫을 사용하여 시약의 저장뿐만 아니라를 위해 필터의 공간 ~ 200 UL을 유지, 필터 1.8ml 용해 버퍼를 추가합니다.
3. Parafilm의 작은 조각으로 Sterivex 필터의 하단과 상단을 밀봉하고, 날짜와 샘플 식별과 필터를 라벨.
4. -80에서 미리 표시 50 ML 팔콘 튜브에 필터를 저장 ° C
5. 주택 단위에서 필터를 제거하고 용해 버퍼 2 ML를 포함하는 표시 50 ML 팰컨 튜브에 그들을 놓으십시오. -80에서 이들을 보관 ° C.를
대청소
1. 최종 정리, 0.1 M HCL을 포함하는 플라스크에 상자 속에 든 대형 유리병 안에 튜브를 삽입
2. 원래 상자 속에 든 대형 유리병에 4L 술병으로 이어질 튜빙을 직접.
3. 펌프 스위치를 원래의 상자 속에 든 대형 유리병에서 실행을 통해 흐름을 수집, 3 실행합니다.
4. 마지막으로, autoclaved 물을 튜빙을 씻어.

대표 결과 : 최종 결과 두 Sterivix 필터 0.22μm와 2.7μm의 크기 범위에서 약 10 L의 해수에서 미생물 바이오 매스를 포함하는 각각 구성되어 있습니다. 이것은 용해 버퍼에 저장된 및 DNA 추출을위한 준비가되었습니다. 또한,이 절차를 수집하고 GF / D prefilters에, 2.7 μm의보다 큰 바이오 매스를 집중하고 있습니다. 이것은 또한 용해 버퍼에 저장된 및 DNA 추출을위한 준비가되었습니다. 추가 처리 단계를 촬영하는 경우, 흐름을 통해 0.22 μm의는뿐만 아니라 바이러스 분수를 수집 아래로 집중하실 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

그것은 달리 장비를 부식 것이다 소금물의 느린 흔적을 제거하는 데 사용 후 젖은 수건으로 벤치와 펌프를 닦아 필수적입니다. 절차는 간단하지만, 시간 요구 사항이 필터링되는 예제에서 바이오 매스이나 먼지의 농도에 따라 광범위한 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. 도스는 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 투자 센터에서 장학금으로 지원했다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse