En direct l'imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale
Summary
Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.
Abstract
Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode de notre laboratoire a développé pour analyser les changements de forme des cellules et des réarrangements nécessaire pour courber et plier le cerveau de poisson zèbre en développement (Gutzman et al, 2008). Une telle analyse permet une nouvelle compréhension de la biologie cellulaire sous-jacentes nécessaires au développement de la structure 3D du cerveau des vertébrés, et augmente considérablement notre capacité d'étudier la morphogenèse du tube neural. Le cerveau de poisson zèbre embryonnaire est façonné à partir de 18 heures après fécondation (HPF) et les ventricules dans le neuroépithélium gonfler. Par 24 HPF, les étapes initiales de la morphogenèse du tube neural sont complets. En utilisant la méthode décrite ici, des embryons au stade une cellule sont injectés avec l'ARNm codant la membrane-cible la protéine fluorescente verte (memGFP). Après l'injection et l'incubation, l'embryon, maintenant entre 18 et 24 HPF, est monté sur le dos dans l'agarose et imagée par microscopie confocale. Notamment, l'embryon de poisson zèbre est transparent ce qui en fait un système idéal pour l'imagerie de fluorescence. Bien que nos analyses ont porté sur la frontière du mésencéphale-rhombencéphale et le rhombencéphale, cette méthode pourrait être étendue à l'analyse de toutes les régions du poisson-zèbre à une profondeur de 80-100 um.
Protocol
Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour l'injection d'ARNm dans les embryons de poissons zèbres seule cellule. Ici, nous utilisons ARNm codant pour la GFP membrane cible d'étiqueter chaque cellule. Nous avons ensuite montrer comment monter et l'image du cerveau en développement à la résolution seule cellule. Cette technique nous a permis d'étudier un nouveau type de cellules changent de forme, la constriction basale, nécessaire à la formation de la frontière du mésencéphale-r…
Acknowledgements
Un grand merci à la Dre Jennifer Gutzman qui a le premier développé cette technique dans le laboratoire Sive. Merci aussi à JB vert au Boston Dana-Farber Cancer Institute, MA qui a aimablement fourni le plasmide codant pour la GFP CAAX-ARNm. L'imagerie confocale a été réalisée à l'installation de WM Keck Foundation Imaging biologique au Whitehead. SH est soutenue par NIHMH70926. EG est soutenu par une provision de pré-doctorat.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
