В этом видео мы продемонстрируем метод, при котором для анализа развивающихся мозга позвоночных в живых эмбрионов данио на одной резолюции ячейки с помощью конфокальной микроскопии. Это включает в себя метод, посредством которого мы вводим одноклеточного эмбриона полосатого данио, а затем смонтировать и изображение развивающегося мозга.
Abstract
В этом видео мы продемонстрируем метод нашей лаборатории разработаны для анализа формы клеток изменения и перестановки требуется согнуть и сложить развивающихся данио мозга (Gutzman и др., 2008). Такой анализ дает новое понимание основных клеточной биологии, необходимые для развития 3D-структуры мозга позвоночных, а также значительно увеличивает нашу способность к обучению нейронных морфогенеза трубки. Эмбрионального мозга данио формируется, начиная с 18 часов после оплодотворения (ФВЧ), а желудочки в нейроэпителия надуваться. К 24 HPF, первые шаги нейронных морфогенеза трубки являются полными. Использование метода, описанного здесь, эмбрионов на стадии одной клетки вводят мРНК, кодирующей мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (memGFP). После инъекции и инкубации эмбриона, в настоящее время от 18 до 24 HPF, монтируется, перевернутый, в агарозном и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Следует отметить, что данио эмбрион прозрачной что делает его идеальной системой для флуоресцентной визуализации. Хотя наши анализы были направлены на средний мозг, задний мозг границы и задний мозг, этот метод может быть распространен для анализа любой регион данио на глубину 80-100 мкм.
Protocol
1. Подготовка мРНК для инъекций МРНК, используемых в этой процедуре расшифрованы с плазмидой, кодирующей CAAX-EGFP (memGFP) мРНК. Первый линеаризовать плазмиды в соответствии с Gutzman и др., 2008. Затем записать memGFP мРНК с использованием mMessage mMachine комплект. Развести в результате мРНК…
Discussion
В этом видео мы продемонстрируем метод мРНК инъекции в одно эмбрионов данио клетки. Здесь мы используем мРНК, кодирующей мембраны ориентированных GFP на этикетке каждой ячейке. Затем показано, как монтировать и изображение развивающегося мозга в одной резолюции клетки. Этот метод позво…
Acknowledgements
Большое спасибо доктор Дженнифер Gutzman который первым разработал эту технику в Sive лаборатории. Спасибо также JB Зеленый в Dana-Farber института рака Boston, MA который любезно предоставил плазмиды, кодирующей CAAX-GFP мРНК. Конфокальной микроскопии было проведено в WM Keck Фонд фонда изображений Биологические на Уайтхеда. HS поддерживается NIHMH70926. Е. поддерживается NSF предварительно докторских стипендий.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
SeaKem GTG agarose
Reagent
Lonza
50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)
Reagent
Sigma
A-5040
Capillary tubing
Tool
Frederick Haer and Co.
30-30-1
Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease
Reagent
VWR
W0S717
Forceps
Tool
Fine Science Tools
11232-20
Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips
Tool
Tip One, US Scientific
111-0806
These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit
Reagent
Ambion
AM1340
SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal
Microscope
Zeiss
Micromanipulator
Tool
Narishige
Microinjector
Tool
Medical Systems Research Products Harvard Apparatus