Summary
交配和四分体分离的遗传分析
Abstract
单细胞绿藻
Protocol
第1部分：配子株的制备
注：所有的操作应在室温下进行。更高或更低的温度会影响受精卵萌发的速度和可能产生不利影响的可行性。
重要的考虑因素：重要的是要交配的菌株是增长强劲，真菌或细菌污染。如果菌株没有经常被转移，通过丰富培养基上应先产生配子。
- 要交配的菌株转移到抽头板（100 × 15毫米），每盘1-2株。细胞生长在一个约1厘米宽的集中地带。
- 应该继续下去，直到一个强劲增长的细胞一层厚厚的存在，如有必要的中间传输的TAP板的孵化。尚未最近代的菌株可能需要一个通道，共1周，而经常使用的野生型菌株可能只需要几天没有通道。光敏感的突变体，可能需要更多的时间。
- 从TAP板的所有细胞转移到N10的板，这是缺乏氮，将开始诱导配子。转让厚板坯的细胞，就像他们在水龙头上板。这将有利于随后的细胞集合。 N10的3天之后，细胞准备接受配子。将N10的细胞分裂缓慢，但细胞应保持深绿色。可行的受精卵将无法获得任何受污染的菌株应该抛弃。
第2部分：交配
- 每一株转移到50毫升锥形瓶中，并在约2.5毫升无菌蒸馏水悬浮。这是可以做到，无论是用一根铁丝环或无菌棒，最重要的是细胞以及暂停，并在团块。水的确切数量应进行调整，使细胞浓度，如用肉眼来衡量，是对每一株相同。
- 细胞是激动的强光下（1.260μE /米2 /秒 ），2小时，在这段时间内的细胞将成为运动型配子。应检查光显微镜下蠕动。如果配子不善游泳，交配可能是低效的。然而，即使是不好的运动型菌株交配频率下降。
- 接下来，平等卷MT和MT -配子结合成一个单一的50 ml容量瓶中。配子留在强光下（1.260μE /米2 /秒 ），不躁动。
- 在光学显微镜下，交配，可以立即检查。对配子形成迅速，而且会出现快速移动的细胞鞭毛加入。如果交配似乎极为迅速，样品应采取30分钟-1小时内生成的受精卵。如果没有，可以交配检查每一个小时，虽然这是可选的。由于倍，给予最佳的受精卵密度会有所不同十字架之间广泛，最好是在不同时期采取等份混合交配后1小时，2小时，3小时和4小时后相结合的配子，例如。这是通过转让300μL为TAP - 3％DIFCO琼脂60 × 15毫米板样品，每盘3-4点。要小心不要搅动混合交配，因为这可能会破坏交配对。 DIFCO琼脂使用，因为它比售价较低的琼脂较少的污染物，它会更容易看到，在显微镜下的受精卵。
可以留在未使用的混合交配烧瓶中过夜，第二天交配反应的质量将得到明显。交配时是有效的，受精卵将坚持在墙上或烧瓶底部，中期将出现明确。甚至烧瓶中搅拌，将无法驱逐的受精卵。如果没有坚持的混合物时，合理的活力激动玻璃，然后交配是低效或未能成行。 - 分接开关Difco公司板包含交配混合物干燥后在无菌罩，盖半掩，直到任何表面的液体被吸收。板块通常是留在18小时（700℃/米2 /秒）的光，然后在铝箔包裹，因为zygospore成熟只会在黑暗的地方。菌株划线，交配时间和日期写板和箔。板存储5至7天，并可以保持较长，虽然合子萌发效率逐步下降。
第3部分：四分体解剖
- 植物细胞应刮掉干点交配的混合物，如手术刀，用钝的刀片。刀片可用于暴露面积的受精卵，将坚持严格的3％琼脂。这一步通常是在下午进行，使受精卵第二天早晨发芽，但还没有发生第二，营养师收益率8后代。衣生物学家很快就学会认识到，在显微镜下的受精卵，因为它们比营养细胞大，并配备了厚厚zygospore的墙，给出了一个黑色的轮廓。 Zygospores经常出现黄色的，但也可能是有点绿色。最重要的品格是，他们坚持以琼脂，而营养细胞很容易移到一边。然而，如果过于干燥板这会不会是这样。此外，如果交配混合物过于密集，受精卵可能形成一个垫子，这将使转让个人受精卵很难或者不可能。在步骤2.1中建立适当的密度，将很快与经验教训。
- 玻璃针准备为收集受精卵和分离四分后代。这些都是准备拉3毫米的玻璃棒，小火焰，生成一个长而细的的螺纹，可折断。这些锥形目的是平滑的提示或弯曲成钩，在低的火焰（如酒精或燃烧的匹配）的简要加热。准备3个或更多的玻璃针，因为他们很容易地打破，特别是对没有经验的用户。
- 受精卵都聚集在3％的TAP - Difco公司使用的玻璃针成一小堆的板。一个平方米的琼脂（可达0.5厘米2），其中包含的受精卵形成和使用沉闷的手术刀切除。然后，琼脂块放在正面朝下一个15毫米的1.5％TAP Difco公司板，下滑沿板顶部约1.5厘米的水平线，分发的受精卵。顶部的水平线，和一个约1.5厘米，水平和垂直间距0.5厘米的网格蚀刻成板的背面。网格将用于翌日作为一个分离的四分体的后代（网格，也可以一天清扫蚀刻）的指导。最后，单个受精卵移动到每条垂直线顶端的水平线的交叉点，约20-30％合子板。虽然只有12家左右将被解剖，而不是每一个受精卵发芽，有的将划分爆破前的两倍，那么多余的受精卵是必要的。
- 后分发和植物细胞的受精卵，已不慎从3％琼脂平板转移被杀害揭露为30秒，在一个玻璃盘，含薄（1-2毫米）的氯仿层倒板。板和氯仿之间的距离应为5厘米左右。如果使用太多氯仿，如果距离过小或伟大，一个风险要么杀死受精卵或不杀生的营养细胞。 zygospores分布在发芽板，以确保选择性，氯仿治疗必须立即进行。
- 发芽需16-20小时，大多数菌株，但会有所不同基因型与受精卵的年龄。发芽，板放置在弱光下（239℃/米2 /秒），或在中等光线变暗覆盖板，用纸巾。
- 发芽的受精卵与它们内部的女儿细胞肿胀，有时甚至爆裂的细胞显微镜下可以识别。 ，如果zygospore没有破裂，轻轻触摸玻璃针将打破墙，如果发芽发生。轻轻拖动到下面的受精卵的格点的子细胞。这是最容易做的捕获少量的玻璃针的压力从琼脂发布的液体培养基中的细胞，并拖着这个“水坑”针。一个“保险”之一，解剖一个受精卵，而不是一个营养细胞，曾两次被划分，的形式，除了四个子细胞，“皮肤”的zygospore墙将保持不变。
- 解剖后代的成长，在适当条件下可用于后续的分析，直到可见clonies回升。板材应每天监测污染。
注：代营养二倍体不在这里，但主要涉及电镀交配混合介质，将不支持或者父母的压力增长，但将支持二倍体的增长（例如，两个不同的auxotropic标记）。板都保存在光线，以避免形成受精卵。
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Discussion
遗传分析是简单的在衣 ，但它需要特别的技术，以产生配子和独立的四分体后代。与健康株，这些技术很容易掌握。一些突变株，它成为一门艺术，和读者应参考最近出版的衣历史笔记的原始资料和实用提示第1卷。此外，应该指出的是，有许多变化的基本主题，如上所述，从方法诱导配子，受精卵分布和解剖模式。最终，每个研究员认为自己的舒适区，或适应实验室专用协议。
上述的一些技术细节，应该加以重申。特别是，这些细胞必须是健康的，并没有任何感染。这是众所周知的实验室适应长时间没有越过株可能没有队友，和水的质量也可能会影响配子。
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Acknowledgments
该协议是基于在实验室研究所生物学物理化学公司，巴黎，法国的弗朗西斯，安德烈沃尔曼学到的技术。作者欠报恩韦芝Bascou，原本星展，以基因工程技术生产的衣，衣在作者实验室的研究是由美国国家科学基金会奖MCB - 0646350的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CC-125 | Mating type plus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| CC-124 | Mating type minus strain | Chlamydomonas Stock Center | ||
| Tris-Acetate-Phosphate (TAP) | Growth medium | |||
| N10 | Growth medium | |||
| Difco agar | Reagent | |||
| Fisherbrand Stainless-Steel Blades | Tools | Fisher Scientific | 08-916-5B | |
| BD Surgical Blade Handles | Tools | Fisher Scientific | 08-914-5 | |
| Fisherbrand Metal Scalpels | Tools | Fisher Scientific | 08-920A |
References
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).
