Summary
パーキンソン病は、実験的に6 - OH -ドーパミンにより誘導することができます線条体へのドーパミン作動性神経支配の喪失によって引き起こされる。我々は、定位病変を実行するとマウスのアポモルヒネ誘発回転動作を監視する方法について説明します。このモデルでは、パーキンソン病に対する新しい治療法をテストするのに便利で信頼性の高いです。
Abstract
パーキンソン病（PD）は、性別に関係なく、世界中で少なくとも650万人、、、社会、民族、経済的、または地理的な境界に影響を与えます。このような振戦、剛性とbradikinesiaなどの主要な症状は、ドーパミン作動性細胞の3 / 4が黒質で失われているときに開発し、線条体のモーター回路の滑らかな、協調制御を提供するために失敗する。うつ病と幻覚が一般的であり、認知症は最終的に患者の20％で発生します。この時点で、PDの進行を遅らせたり、停止するための治療法はありません。これらの症状の緩和に向けたよりむしろ、薬現在利用可能な目的。新しい外科的戦略は可逆的脳深部構造の電気刺激によって機能的に損傷を受けた回線に切り替えることがありますが、脳深部刺激は大きな前進ですが、それはすべての患者には適していません。したがって、前臨床モデルで新たな細胞療法のアプローチをテストするために必要なままです。
ドーパミン作動性経路の選択的な神経破壊は、薬物や酸化、有害な化学物質を枯渇させるのに対し、6 - ヒドロキシドーパミンの注射（6 - OHDA）またはMPTP（1 - メチル-4 - フェニル-1,2,3,6 - tertahydropyridine）で再現できる可能性がありますまた、げっ歯類におけるPDの特定の機能を再現。 MPTPとは異なり、6 - OHDAの病変は、大規模な不可逆的な神経細胞の損失を引き起こす、および単方向または二国間することができます。 6 - OHDAの病変モデルの信頼性が高い、堅牢な運動障害につながる、とrats1の研究の40年後に最も広く使用されています。移植細胞と宿主間の相互作用は、現在マウスではなくラットでより徹底的に調査することができるように、モデルがそれは最近4を特徴としているマウスの2,3、に移調されています。
このビデオでは、我々はどのように徐々に定位的に挿入マイクロシリンジの針を介して6 - OHDAの2.0μLを提供することにより、病変麻酔したマウスの左nigro - 線条体経路をに示す。ドーパミン作動性入力の損失は、日以内に発生し、機能障害は、ドーパミン作動薬5によって誘導される評価の動物の回転により、術後数週間、数ヶ月にわたって監視することができます。ここでは、病変の後一ヶ月に測定、アポモルフィンの単回皮下投与後10分に発生した、フルボディ対回転を示しています。成果と欠点を以下に説明されています。
Protocol
このような6 - OHDAとアポモルフィンなどの固体の形で格納されているすべての化学物質は、汚染を避けるために、無菌注射用水で希釈し、層流フードの内部にろ過した。さらに、神経毒と神経活性物質は、格納されたプリペアド、処理され、国際的なガイドライン6、地元のバイオセーフティ委員会によって設定された規則にしたがって配置した。
1 - 麻酔と手術
成体雄のスイスマウス（25〜30グラム）は迷走神経の緊張を減らすためにアトロピン（0.2 mg / kgを、SC）でpremedicatedとケタミン（90〜120 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）の腹腔内注射でその後麻酔されています。動物は、鎮静の誘導は、いくつかの分を取ると、体温が37℃に維持されるように電子制御ヒーティングパッド（インサイト）に配置されます。麻酔レベルは、撤退の反射がないことをテストすることによって、作業中はチェックされます。麻酔薬投与量は、それぞれのひずみ/コロニーのためにajustedされるべきである。手術の動物と期間に応じて、ケタミンの追加投与が必要になることがあります。その後、生理食塩水は、塩化ナトリウム（NaCl 0.9％）乾燥から角膜を保護し、この最初の瞬間における瞬目反射の有無をテストするために両眼に適用されます。全体の頭の上に毛皮をunsterileの領域との最小接触を確実にするために、トリマーと剃毛されています。局所麻酔（キシロカイン）が不快感を防ぐために耳のバーに適用されます。撤退と瞬目反射が消えてしまっただけに一度、麻酔のレベルを示すことは十分に深く手術（ステージ3）のためである、動物が特別にこの種（インサイト）のために設計された口ピースと耳のバーを使用して、定位固定フレーム上に配置される。一度positionated、眼科軟膏（マルカ）はすべての手術中の動物の目を保護するために適用されます。目が正しく保護されていることを確認して後にのみ、プロシージャが後滅菌綿の綿棒を使用して、70％エタノール、続いポビドンヨード、次に示す3種類のを繰り返すことにより、外科の領域の皮膚の消毒を続行、耳のバーの適切な配置は、頭の横の動きをテストすることで確保（頭部は棒が十分に固定されるように移動してはいけません）。頭蓋骨のランドマークが明らかにされているときに頭の適切な背腹傾きは後で検証されます。矢状切開（1.5 cm）を滅菌メス（＃15ブレード）で作られています。関心領域にわたって骨膜を穏やかに新しいブレードで掻きされ、そして骨が頭蓋骨のランドマークを発見するために、無菌の視線や綿棒できれいに拭いています：ブレグマは、矢状と冠状縫合の交点として定義され、ラムダながら、矢状縫合とラムダ縫合の左と右の部分を通過するベストフィットラインの交点です。垂直配向基準の針の先端は、最初の手術用顕微鏡で調査を受け、ブレグマでゼロ、およびラムダの点に触れることとして移動されます。ヘッドが適切に配置されている場合、ラムダはブレグマと同じ背腹レベルにする必要があります、そして両方のランドマークはrostro -尾軸に沿って4.2ミリメートルで遠くにする必要があります。されていない場合は、耳のバーやノーズピースはstereotaxical対策のための"フラット頭蓋骨"の参照を定義する目的の位置を、達成するために、緩め、微妙に耳間軸の周りに傾いた頭する必要があります。前後（AP 0.5ミリメートル）と横（L -2.0ミリメートル、左）：リファレンスの針の先端を所望の座標に配置されています。場所は、頭蓋骨にマークされ、小型（1.2 mmの直径）の穴は熱面積を防ぐために、断続的なアクションを使用して、滅菌ドリルビットで開かれます。骨片は、慎重に歯科キュレットを用いて除去し、無菌温かい0.9％のNaClで洗浄する。滅菌5μlのハミルトンシリンジ（26Sゲージ、0.47ミリメートル、外径）が6 - OHDAのソリューション（または対照動物のための車）でロードされ、垂直に定位固定装置に配置されます。針の先端（タイプ2または12 °ベベルが）その後、背腹座標の基準点を決めるかも、軟膜表面に触れるまで、開いた穴に挿入されます。一度この座標を決めるかも、針はゆっくりと線条体の座標（：;：-2.0とDV：-3.0ミリメートル、下の軟膜表面7 L 0.5 AP）に到達するために低下する。準備し、ろ過層流フードの内部に、そして作業中はアルミ箔で光から保護する必要がありますれた6 - OHDA溶液（0.02％アスコルビン酸と塩化ナトリウム0.9％10μgの6 - OHDA）、、その後に注入される0.1μL/minの流量。対照動物の場合は、車両の等量（0.02％アスコルビン酸と滅菌水のNaCl 0.9％）を注入する。全体の2.0μLを注入されると、注射器は、5分よりも劣らずで、非常にゆっくりと脳から退避される前に5分間の場所に保存されています。頭蓋骨はクリアされ、切開は＃6から0ナイロン縫合糸（シャロン）を使用してクローズされます。余分を取るために感染症に対する治療、ネオマイシンなどの局所抗生物質軟膏は、、縫合皮膚に適用してもよい。動物は、フレームから削除脱水を防ぐために、生理食塩水0.5mlの（sc.）を与え、そして完全な回復までは暖かいと密接な観察下に保存されています。彼らはその後、食料と水を自由に収容されています。鎮痛、手術後の最初の2日間飲料水のボトルに追加されます（5.5 mlの日平均水使用量、および体重/日の0.03 mgのイブプロフェン/ gの推奨用量を与え、20mgの0,82 mLを加え/ mLのイブプロフェン-アボット100mLの飲料水に懸濁液）。マウスは、通常、放浪と容易に水の食品のペレットに手を伸ばす、プロシージャから速やかに回復する。明らかな不快感、または感染の兆候のいずれの場合でも、動物は、ローカルのガイドラインに従って安楽死されるべきである。
2 - 行動テスト
運動障害が週後に観察することができますが、一ヶ月の後の病変の間隔は、回転試験で信頼性の定量の前に許可されています。動物は、DA作動薬のアポモルヒネ（0.5 mg / kg）の皮下注射を受けて、30cmの直径の不透明なシリンダーに配置され、記録のカメラの下に45センチメートルを置いた。各テストの前に、以前に試験動物からの残留物や臭いを除去することが重要です。 5分の馴化期間の後、動きが5分の時間枠を介して記録されます。禁忌と同側のフルボディの回転の両方を測定し、対照群（車両が注入）と比較されます。手順が正しく実行された場合、アゴニストは主に病変側の高感度神経除去線条体を活性化するので、6 - OHDA病変動物は、反対側に回転を開始されるのに対し、対照動物には、任意の回転を示すことはありません。 7回転（毎分少なくとも7フルボディ対回転を表示する）以上をスコア動物が正常に病変として考えられている。動物を安全に毎週繰り返される可能性試験後の彼らのハウジング30分、に戻すことができます。私たちの手では、病変マウスの5％未満では、次善の回転速度を表示します。
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Discussion
nigro - 線条体経路の豊富な一方的な病変は、線条体に6 - OHDAの単一定位注射によりマウスに確実に達成することができます。病変の程度は、ビデオに示す。、（DA、すなわちL -チロシンフェニルアラニンへの変換の合成の段階にレート制限を触媒する）チロシン水酸化酵素の免疫組織化学による事後検証することができます
生体内で、アポモルヒネにより誘発される対の回転はアンフェタミン誘発性同側の回転8より最大線条体病変のよりよい予測因子である。したがって、病変の機能的影響は、アポモルヒネ誘発性対側回転の簡単な測定によって、数ヶ月にわたって監視することができます。
成功率は約95％である。それは通常、広範なドーパミン枯渇は神経毒の倍数の注射を必要とし、死亡率を増大するラット（50〜70％）について報告されているものよりもかなり高いです。マウスでは、実験条件は、重量に一致する、とだけ作りたての6 - OHDAのソリューションを使用しての動物を選択することにより標準化されるべきである。他のグループは、異なる濃度および/または神経毒のボリュームを使用するかもしれないが、我々は6 - OHDA（酸化を防ぐために、0.02％アスコルビン酸を含む）の5 mg / mlの生理食塩水2mlのが最大の病変のための最も効率的であることが判明している。また、最大下注射は、ヒトの、特にPD 9の若年と早期発症のフォームで発生するドーパミン作動性端末の進行性変性を模倣できると便利かもしれません。
MPTPの病変は自然回復につながる、とさらに性別、年齢、およびひずみに敏感である可能性があります。最近の研究では、これは線条体の中だけでなく、すべての黒質におけるTH陽性細胞の数に残留DAのコンテンツの大規模と長期的な削減をもたらすマウスの6 - OHDAの病変の場合、ではないことを示してマウスは10をテストした。
広範囲にラットで約40年間使われている - - 現在時刻、パーキンソンの6 - ヒドロキシドーパミン病変のモデルでは、確実にマウスに置き換えることができます。我々は、このビデオは他のグループに有用となることを願っています、そしてそれによってPD 11の新しい細胞治療に関する臨床研究に必要な実験や動物の数を減らす。
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Disclosures
実験は神経科学における哺乳類の管理と使用に関する国際的ガイドラインに準拠して行動の研究で実施した
Acknowledgments
FundaçãoパコデアンパロPesquisaでサポートされているエスタードは、リオデジャネイロ（FAPERJ）とConselhoナシオナルデDesenvolvimento Científico電子モンテ（CNPqを）行うのですか。我々は、そのコメントは私が原稿とビデオの両方を向上させる助け匿名のレフェリーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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