Summary
파킨슨 질환은 실험적으로 6 - OH - 도파민에 의해 유도된 수있는 striatum에 dopaminergic innervation의 손실로 인해 발생합니다. 우리는 stereotaxic 병변을 수행하고 생쥐에서 apomorphine 유발 회전 동작을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 유용하고 파킨슨 질환에 대한 새로운 치료법을 테스트하기 위해 신뢰할 수 있습니다.
Abstract
파킨슨병 (PD)는 성별에 관계없이 전세계적으로 최소한 6백50만명, 사회적, 민족, 경제, 또는 지리적 경계에 영향을 미칩니다. 이러한 떨림, 강성 및 bradikinesia 같은 주요 증상, dopaminergic 세포 3 / 약 4는 substantia 니그라에서 길을 잃었 때 개발하고, striatal 모터 회로의 부드러운 조정 규정을 제공하기 위해 실패합니다. 우울증 및 환각이 일반적이며, 치매는 결국 환자의 20 %에서 발생합니다. 이때 PD의 진행을 지연하거나 중지시킬 치료가 없습니다. 이러한 증상의 경감을 향해 오히려 약물은 현재 사용 가능한 목표 더. 새로운 외과 전략 reversibly 깊은 뇌 구조의 전기 자극을 통해 기능적으로 손상된 회로에 스위치를 수 있지만 깊은 두뇌 자극이 주요 발전이지만, 그것은 모든 환자에 대해 적합하지 않습니다. 그것은 따라서 잠복기 모델에 새로운 세포 치료 방법을 테스트하는 데 필요한 남아 있습니다.
dopaminergic 경로의 선택 neurotoxic 장애는 마약과 산화 - 유해한 화학 물질을 파괴하는 것이 있습니다 반면 (1 - 메틸 -4 - 페닐 - 1 ,2,3,6 - tertahydropyridine) 6 - hydroxydopamine (6 - OHDA) 또는 MPTP의 주입에 의해 복제 수 있습니다 또한 설치류에 PD의 특정 기능을 재생산한다. MPTP와는 달리, 6 - OHDA의 병변은 거대한 돌이킬 수의 연결 손실을 발생하고, 단일 또는 양자 수 있습니다. 6 - OHDA 병변의 모델은 신뢰할 수있다, 강력한 모터 적자로 연결하고, 가장 널리 rats1 연구의 40 년 후 사용됩니다. 이식할 세포와 호스트 사이의 상호 작용 지금 아니라 쥐보다 마우스에 더 철저하게 공부를 할 수 있듯이, 모델은 그것이 최근 4 특징되었습니다 마우스 2,3로 바뀜되었습니다.
이 비디오에서는, 우리는 어떻게 천천히 stereotaxically 삽입된 마이크로 주사기 바늘을 통해 6 - OHDA 2.0 μL를 제공함으로써 병변 anesthetized 마우스의 왼쪽 nigro - striatal 통로를 보여줍니다. dopaminergic 입력 손실 일 이내에 발생하고, 기능 장애가 dopaminergic 요원 5 유도 등급 동물 회전에 의해 게시물 수술 주 개월 동안 모니터링할 수 있습니다. 여기, 우리는 apomorphine의 단일 피하 관리 후 10 분 발생하는 전신 contralateral 회전은 병변 후 한 달 측정 보여줍니다. 결과과 단점은 아래에 설명되어 있습니다.
Protocol
등 6 OHDA과 apomorphine으로 고체 형태로 저장된 모든 화학 물질은, 무균 주입 물에 희석하여 오염을 피하기 위해, 층류 후드 내부 필터링되었습니다. 또한, 신경 및 neuroactive 물질은 저장 준비 처리 및 국제 지침 6 지역 Biosafety위원회가 정한 규정에 따라 처리되었습니다.
1 - 마취과와 수술
성인 남성 스위스 생쥐 (25~30그램)은 vagal 톤을 줄이기 위해 아트로 핀 (0.2 MG / kg, SC)와 premedicated와 케타민을 (90-120 밀리그램 / 킬로그램)과 Xylazine (10 MG / kg)의 intraperitoneal 주사와 함께 다음 anesthetized 아르 . 동물은 체온이 37 ° C 유지를 진정 작용의 유도가 몇 분 정도 걸립으로 보장하기 위해 전자 제어 손난로 (통찰력)에 배치됩니다. 마취 수준은 탈퇴 반사의 부재를 테스트하여 프로 시저를 통해 확인합니다. 마취 주사 량은 각 변형 / 식민지에 대한 ajusted해야합니다. 수술의 동물과 기간에 따라, 300ml의 추가 복용이 필요할 수 있습니다. 그 후, 생리 (NaCl 0,9 %)이 밖으로 건조에서 각막을 보호하고 첫번째 순간에있는 the blink 반사의 부재를 테스트하는 두 눈에 적용됩니다. 전체 머리 가죽 unsterile 영역 최소 접촉을 보장하기 위해 트리머로 면도있다. 국소 마취제 (Xylocaine)는 불편을 방지하기 위해 귀 바에 적용됩니다. 철수와 깜박 반사가 사라졌다는 한 번만, 마취의 수준을 나타내는 것은 깊은만큼 수술 (단계 3)이고, 동물은 특별히이 종 (인사이트)을위한 입 피스와 귀 막대를 사용하여 stereotaxic 프레임에 배치됩니다. 일단 positionated, ophthalmologic 연고 (마르카)는 모든 수술에 걸쳐 동물 눈을 보호하기 위해 적용됩니다. 눈을 제대로 보호하고 있는지 확인 될 경우에만, 절차 후 불임 코튼스 면봉을 사용하여 70 % 에탄올 다음 povidone 요오드 세 응용 프로그램을 반복하여 수술 영역의 피부의 소독과 함께 계속 귀를 바의 적절한 배치가 머리의 측면 움직임에 대한 테스트에 의해 보장 (머리가 바가 안전하게 고정되는 것을 보장하기 위해 이동하지합니다.) 두개골의 랜드마크가 발표 때 머리 적절한 dorsoventral 경사는 나중에 확인됩니다. 화살 절개 (1.5 cm)는 멸균 메스 (# 15 블레이드)로 이루어집니다. 관심 분야를 통해 골막은 부드럽게 새로운 블레이드와 거리 스크랩한이며, 뼈가 두개골 명소를 발굴하기 위해 무균 시선과 목화 면봉로 닦아입니다 bregma는 화살과 코로나 봉합의 교차 지점으로 정의되어있는 동안 람다 화살 봉합사의 교차로와 lambdoid 봉합의 왼쪽과 오른쪽 부분을 통과 가장 맞는 라인의 요점입니다. 세로 정렬 기준 바늘의 팁을 먼저 수술 현미경을 통해 시험에서 bregma에서 제로와 람다 지점을 터치로 다음 이동합니다. 머리가 올바르게 위치하는 경우, 람다는 bregma 같은 dorso - 복부 수준에 있어야하고, 두 랜드마크 rostro - 꼬리 축을 따라 4.2 mm에서 멀리 떨어져 있어야합니다. 그렇지 않다면, 귀 바, 코받침이요은 느슨하게해야하며 머리가 있으니까 stereotaxical 조치에 대해 "평면 두개골"참조를 정의 원하는 위치를 달성하기 위해, interaural 축을 중심으로 기울어져. 참조 바늘 끝은 다음 원하는 좌표에 위치하고 있습니다 앞쪽에 - 후부 (AP 0.5 mm)과 (L -2.0 mm, 왼쪽) 측면. 위치는 두개골에 표시된이며 소형 (1.2 mm 직경) 구멍 열 영역을 방지하기 위해 간헐 동작을 사용하여 소독 드릴 비트와 함께 열립니다. 뼈 조각은 신중하게 치과 퀴렛로 제거하고 멸균 따뜻하고 0.9 % NaCl로 세탁합니다. 멸균 5 μl 해밀턴 주사기 (26s 게이지, 0.47 mm 외경)은 6 - OHDA 솔루션 (또는 제어 동물 차량)와로드 및 수직 stereotaxic 장치에 정렬됩니다. 바늘의 팁 (2 형 또는 12 ° 베벨)은 다음 dorso - 복부 좌표의 기준점를 따지기, 터치 pial 표면까지 열린 구멍에 삽입됩니다. 일단이 좌표를 따지기, 바늘이 천천히 (:; : -2.0 및 DV 아래의 -3.0 mm, pial 표면 7 L 0.5 AP = 연합 뉴스) striatum의 좌표에 도달할 저하됩니다. 준비 및 층류 후드 내부 필터링, 그리고 절차를 통해 알루미늄 호일에 의해 빛으로부터 보호되어야합니다되었다 6 - OHDA 솔루션 (0.02 %의 아스코르비 산 10 μg 6 - OHDA 0.9 % NaCl)을, 다음에 주입 0.1μL/min의 유량. 컨트롤 동물, 차량의 동일한 볼륨 (0.02 %의 아스코르비 산 및 멸균 물의 NaCl 0.9 %)가 주입됩니다. 전체 2.0 μL를 주입되면 매우 느리게 두뇌에서 철회되기 전에, 주사기는 5 분 이상 이하에서 5 분 장소에 보관됩니다. 두개골은 청소되고 절개는 # 6-0 나일론 봉합사 (Shalon)를 사용하여 닫힙니다. 추가을 위해감염에 대한 치료는 이러한 네오 마이신과 같은 항생제 연고 지역은, 봉합 피부에 적용될 수 있습니다. 동물은 탈수를 방지하기 위해 호수 (sc.)의 0.5 ML 주어진 프레임에서 제거하고, 따뜻하고 완전 복구까지 가까운 전망대 아래에 보관됩니다. 그들은 그 음식과 물을 광고 libitum와 함께 지내게됩니다. 진통제는 수술 후 처음 두 일 (5.5 ML의 일일 평균 물 소비량 부여에 대한 식수 병 및 바디 무게 / 하루 0.03 MG의 이부 프로펜 / g의 권장 복용량에 추가됩니다; 20 MG의 0,82 ML을 추가 / ML 이부 프로펜 - 애보트 서스펜션 100 ML의 식수로). 마우스는 일반적으로 방황하고 쉽게 물 식품 알약에 대한 도달, 절차에서 신속하게 복구합니다. 명백한 불편, 또는 감염의 서명의 경우에는 동물 지방 지침에 따라 euthanized해야합니다.
2 - 행동 검사
모터 장애가 주 후 관찰 될 수 있지만, 1 개월 후 병변 간격은 회전 테스트를 신뢰할 수있는 부량 전에 허용됩니다. 동물 DA의 작용제의 apomorphine (0.5 밀리그램 / 킬로그램)의 피하 주사를 수신하고, 30cm 직경의 불투명 실린더에 배치됩니다, 녹음 카메라 아래에 45cm를 배치. 각 테스트하기 전에 이전에 시험 동물에서 어떤 잔류물과 냄새를 제거하는 것이 중요합니다. 5 분 요법 이니 기간 후 운동은 5 분 기간 동안 기록됩니다. 모두 콘트라 및 ipsilateral 전신 순환은 측정 및 제어 그룹 (차량 주입)과 비교됩니다. 절차가 올바르게 수행 경우 작용제는 주로 lesioned 측면에 과민한 denervated striatum을 활성화 이후 6 OHDA lesioned 동물, contralateral 측면으로 회전하기 시작합니다 반면, 제어 동물은 어떤 회전을 전시하지 않습니다. 7 RPM (분당 최소 7 전신 contralateral 회전을 표시)을 통해 점수 동물이 성공적으로 lesioned로 간주됩니다. 동물이 안전하게 매주 반복 수있는 시험 후 자신의 주택 30 분에 제공될 수 있습니다. 우리 손에, lesioned 생쥐 미만 5 % suboptimal 회전 속도를 표시합니다.
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Discussion
nigro - striatal 경로를 광범위하게 일방적으로 병변이 striatum에 6 - OHDA의 단일 stereotaxic 주사로 쥐에서 안정적으로 얻을 수 있습니다. 병변의 범위는 같은 동영상에 그림, (DA의 합성의 단계를 제한 속도, dihydroxyphenylalanine에 L - 티로신의 즉, 변환을 catalyses)을 티로신 Hydroxylase에 대한 immunohistochemistry하여 사후 확인하실 수 있습니다.
생체내에서 apomorphine에 의해 유발 contralateral 회전은 암페타민 유발 ipsilateral 회전 8보다 최대한 striatal 병변의 더 나은 예측하고 있습니다. 따라서 병변의 기능적 결과는 apomorphine 유발 회전 contralateral의 직접적인 측정에 의해 몇 개월 동안 모니터링할 수 있습니다.
성공률은 약 95 %입니다. 그것은 일반적으로 광범위한 dopaminergic 고갈이 neurotoxin의 배수 주사가 필요하며 사망률을 증가하는 쥐 (50~70%)에 대한보고 무엇보다 훨씬 높습니다. 생쥐에서 실험 조건은 무게를 일치의 동물을 선택하여 표준 수 있으며, 오직 신선한 6 - OHDA 솔루션을 사용해야합니다. 다른 그룹은 다른 농도 및 / 또는 neurotoxin의 볼륨을 사용할 수 있지만, 우리는 6 - OHDA (산화를 방지하기 위해 0.02 %의 아스코르비 산을 포함)의 5 MG / ML 생리 식염수 2 ML은 최대한의 병변에 대한 가장 효율적인 것을 발견했습니다. 또는, submaximal 주사는 인간, 특히 PD 9 청소년 및 초기 발병 형태에서 발생 dopaminergic 단말기의 진보 변성을 모방하는 것이 유용할 수 있습니다.
MPTP의 병변은 자연 회복으로 이어질하고, 또한 성별, 연령 및 변형에 민감 수 있습니다. 최근 연구는이 문서의 striatum 내에 잔류 DA 내용에 대규모와 오랜 지속 감소를 얻을 생쥐에 6 - OHDA의 병변에 대한 경우뿐만 아니라 모든 substantia 니그라에서 TH 양성 세포의 숫자처럼되지 않았음을 나타냅니다 마우스는 10 테스트.
현재, 파킨슨병의 6 hydroxydopamine 병변 모델 - 광범위 쥐 40 년 동안 사용되었습니다있는가 - 안정 마우스로 바뀜 수 있습니다. 우리는이 비디오를 다른 그룹에 도움이 될 것입니다 희망하고, 따라서 PD 11 새로운 세포 요법의 잠복기 연구에 필요한 실험 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
실험 국제 신경 과학에있는 포유류의 관리 및 사용에 대한 지침과 행동 연구에 따라 수행되었습니다
Acknowledgments
Fundação 데 Amparo 지원 Pesquisa 에스타는 리우데 자네이루 (FAPERJ)와 Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)을해야합니까. 우리는 누구의 의견이 우리가 원고와 비디오를 동시에 개선하는 데 도움 익명 주심에 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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