Summary
Parkinson-Krankheit ist durch den Verlust von dopaminergen Innervation des Striatum, die experimentell durch 6-OH-Dopamin induziert werden können verursacht werden. Wir beschreiben, wie eine stereotaktische Läsion durchzuführen und Apomorphin-induzierte Drehverhalten in Mäusen zu überwachen. Dieses Modell ist nützlich und zuverlässig für die Erprobung neuer Therapien für Parkinson-Krankheit.
Abstract
Morbus Parkinson (PD) betrifft mindestens 6,5 Millionen Menschen weltweit, unabhängig von Geschlecht, sozialer, ethnischer, wirtschaftlicher oder geografische Grenzen. Key Symptome wie Tremor, Rigor und bradikinesia, entwickeln sich, wenn etwa 3 / 4 der dopaminergen Zellen in der Substantia nigra sind verloren, und nicht, um für den reibungslosen und koordinierten Regelung der striatalen Motorstromkreisen bieten. Depression und Halluzinationen sind häufig, und Demenz tritt schließlich in 20% der Patienten. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Behandlung zu verzögern oder stoppen das Fortschreiten der PD. Vielmehr sind die zurzeit verfügbaren Medikamente zielen stärker auf die Linderung der Symptome. Neue OP-Strategien können reversibel an das funktionell beschädigt Schaltungen durch die elektrische Stimulation von tief Hirnstrukturen wechseln, aber obwohl die tiefe Hirnstimulation ist ein bedeutender Fortschritt, ist es nicht für alle Patienten geeignet. Es bleibt daher notwendig, neue Zelltherapie Ansätze in präklinischen Modellen zu testen.
Selektive neurotoxische Störungen des dopaminergen Bahnen können durch Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) oder MPTP reproduziert werden (1-Methyl-4-phenyl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), während abbauenden Drogen und oxidative-schädliche Chemikalien können auch reproduzieren Besonderheiten der PD bei Nagetieren. Im Gegensatz zu MPTP, verursachen 6-OHDA Läsionen massiven irreversiblen Verlust von Nervenzellen und kann uni-oder bilateral. Die 6-OHDA Läsion Modell ist zuverlässig, führt zu robusten motorische Defizite, und ist die am weitesten nach 40 Jahren Forschung in rats1 verwendet. Da Wechselwirkungen zwischen transplantierten Zellen und Gastgeber können nun genauer in Mäusen als bei Ratten untersucht werden, hat das Modell bei Mäusen 2,3, wo es vor kurzem 4 gekennzeichnet umgesetzt worden.
In diesem Video zeigen wir, wie man Läsion der linken nigro-striatalen Weg von narkotisierten Mäusen durch langsam liefert 2,0 ul der 6-OHDA durch eine stereotaxically eingefügt Mikro-Kanüle. Der Verlust von dopaminergen Input erfolgt innerhalb weniger Tage, und die funktionellen Beeinträchtigungen können über post-operative Wochen und Monaten nach Bewertung Tier Rotationen von dopaminergen Wirkstoffen 5 induzierte überwacht werden. Hier zeigen wir Ganzkörper-kontralateralen Rotationen auftretenden 10 Minuten nach einer einzigen subkutanen Verabreichung von Apomorphin, gemessen ein Monat nach der Läsion. Ergebnisse und Nachteile werden im Folgenden erörtert.
Protocol
Alle Chemikalien in fester Form gespeichert wird, wie 6-OHDA und Apomorphin, wurden in sterile Injektion Wasser verdünnt und filtriert in einem Laminar-Flow-Haube, um Verunreinigungen zu vermeiden. Darüber hinaus wurden Neurotoxine und neuroaktiven Stoffe gelagert, zubereitet, behandelt und entsorgt werden gemäß den Vorschriften von internationalen Richtlinien 6 und der örtlichen Kommission für Biosicherheit gesetzt.
1 - Anästhesie und Chirurgie
Erwachsene männliche Swiss-Mäuse (25-30g) werden mit Atropin (0,2 mg / kg, sc) vorbehandelt, um Vagotonus zu reduzieren und dann betäubt mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (90-120 mg / kg) und Xylazin (10 mg / Kg) . Das Tier ist auf einer elektronisch gesteuerten Heizkissen (Insight) platziert, um sicherzustellen, Körpertemperatur bei 37 ° C gehalten, wie die Induktion von Sedierung dauert einige Minuten. Die Anästhesie-Ebene ist während des gesamten Verfahrens durch die Prüfung der Abwesenheit des Rücktritts Reflex überprüft. Betäubungsmittel Dosierung sollte für jeden Stamm / Kolonie ajusted werden. Je nach Tier und Dauer der Operation, können zusätzliche Dosen von Ketamin notwendig sein. Danach wird Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) auf beiden Augen aufgetragen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen und testen Sie die Abwesenheit des Blinkreflex in diesem ersten Augenblick an. Das Fell über die gesamte Kopf ist mit einem Trimmer rasiert wie möglich den Kontakt mit unsterilen Bereichen zu gewährleisten. Lokalanästhetikum (Xylocain) ist an das Ohr Bars angewendet, um Beschwerden zu vermeiden. Nur einmal Entzug und Blinkreflex sind verschwunden, die den Grad der Narkose ist tief genug für Chirurgie (Stufe 3), wird das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen mit Mundstück und Ohr Bars speziell für diese Art (Insight) konzipiert positioniert. Sobald positionated, eine augenärztliche Salbe (MARCA) wird angewandt, um das Tier die Augen über alle Operationen zu schützen. Erst nachdem sicher sein, dass die Augen richtig geschützt sind, das Verfahren mit der Desinfektion der Haut des chirurgischen Region weiterhin durch Wiederholung drei Anwendungen von Povidon-Iod mit 70% Ethanol gefolgt, mit sterilen Tupfern Baumwollstoffe Nach, ist die richtige Platzierung des Ohres Bars gewährleistet durch die Prüfung für Seitwärtsbewegungen des Kopfes (der Kopf darf sich nicht bewegen, um sicherzustellen, dass die Balken sicher befestigt sind). Proper dorsoventrale Neigung des Kopfes wird später überprüft werden, wenn Schädel Wahrzeichen enthüllt werden. Ein sagittaler Schnitt (1,5 cm) ist mit einem sterilen Skalpell (# 15 Klinge) gefertigt. Das Periost über dem Bereich von Interesse ist sanft entfernt mit einem neuen Klinge abgeschabt und der Knochen sauber gewischt, mit steriler Blick und Wattestäbchen, um Schädel Sehenswürdigkeiten entdecken: Bregma als Schnittpunkt der sagittalen und Koronarnaht definiert, während lambda ist der Schnittpunkt der Sutura sagittalis und die beste Passform, die durch den linken und rechten Teile der Lambdanaht. Die Spitze eines vertikal ausgerichteten Referenz Nadel wird zunächst mit dem Bregma Null, geprüft durch das Operationsmikroskop, und wechselte dann als Lambda-Punkt zu berühren. Wenn der Kopf richtig positioniert ist, sollte Lambda gleichzeitig dorso-ventralen Ebene Bregma werden, und beide Wahrzeichen sollte um 4,2 mm entlang der rostro-caudalen Achse entfernt. Wenn nicht, sollten die Ohren Bars und Mundstück werden lockern und den Kopf vorsichtig gekippt um die interauralen Achse, um die gewünschte Position, die die "flachen Schädel" Referenz für stereotaxical Maßnahmen definiert zu erreichen. Die Spitze des Referenz-Nadel wird dann an der gewünschten Koordinaten positioniert: anterior-posterior (AP +0,5 mm) und lateralen (L -2,0 mm, links). Die Lage ist auf dem Schädel markiert und eine kleine (1,2 mm Durchmesser) Loch ist mit einer sterilisierten Bohrer eröffnet, mit intermittierenden Maßnahmen zur Wärme der Umgebung zu verhindern. Knochenfragmente werden sorgfältig mit einer zahnärztlichen Kürette entfernt und mit sterilen warmen 0,9% NaCl. Die sterilisierte 5 pl Hamilton-Spritze (26s messen; 0,47 mm Außendurchmesser) wird mit dem 6-OHDA-Lösung (oder Vehikel für Kontrolltiere) geladen und vertikal in den stereotaktischen Apparat ausgerichtet. Die Spitze der Nadel (Typ-2-oder 12 ° Fase) wird dann in das geöffnete Loch eingeführt, bis berühren pialen Oberfläche, auf den Referenzpunkt der dorso-ventralen koordinieren bestimmte. Sobald bestimmte diese zu koordinieren, wird die Nadel langsam abgesenkt, um die Koordinaten des Striatum zu erreichen (AP: +0,5; L: -2,0 und DV: -3,0 mm, unten pialen Oberfläche 7). Die 6-OHDA-Lösung (10 pg 6-OHDA in 0,9% NaCl mit 0,02% Ascorbinsäure), die bereit und filtriert in einem Laminar-Flow-Haube, und muss von Licht durch Aluminium-Folie während des gesamten Verfahrens geschützt werden, wird dann an injizierten einer Durchflussrate von 0.1μL/min. Für Kontroll-Tieren ist das gleiche Volumen des Fahrzeugs (0,02% Ascorbinsäure und 0,9% NaCl in sterilem Wasser) injiziert. Sobald die gesamte 2,0 ul injiziert wurde, ist die Spritze in Platz für 5 min gehalten, bevor sie ganz langsam aus dem Gehirn zurückgezogen, in nicht weniger als in 5 Minuten. Der Schädel ist gereinigt und der Schnitt wird geschlossen mit einem # 6-0 Nylonfaden (Shalon). Um ein zusätzlichesPflege gegen eine Infektion, kann ein lokaler Antibiotika-Salbe, wie Neomycin, die genäht Haut aufgetragen werden. Die Tiere sind aus dem Rahmen, da 0,5 ml Kochsalzlösung (sc.), um eine Austrocknung zu verhindern entfernt und warm gehalten und unter genauer Beobachtung bis zur vollständigen Genesung. Sie werden dann mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Schmerzmittel, die Trinkwasser-Flasche für den ersten beiden Tagen nach der Operation (bei einem durchschnittlichen täglichen Wasserverbrauch von 5,5 ml und einer empfohlenen Dosierung von 0,03 mg Ibuprofen / g Körpergewicht / Tag aufgenommen, fügen Sie 0,82 mL von 20 mg / mL Ibuprofen-Abbott Suspension auf 100 ml Trinkwasser). Mäuse in der Regel sofort wieder aus dem Verfahren, Wandern und griff nach Wasser Futterpellets leicht. In jedem Fall offensichtlicher Beschwerden oder Anzeichen einer Infektion, sollten die Tiere gemäß den örtlichen Richtlinien eingeschläfert werden.
2 - Behavioral-Test
Obwohl motorischen Beeinträchtigungen nach einer Woche beobachtet werden können, ist eine post-Läsion Abstand von einem Monat, bevor verlässliche Quantifizierung mit der Rotation-Test erlaubt. Das Tier erhält eine subkutane Injektion von DA-Agonisten Apomorphin (0,5 mg / Kg) und ist in einem undurchsichtigen Zylinder von 30 cm Durchmesser platziert, platziert 45 cm unterhalb der Aufnahme-Kamera. Es ist wichtig, damit keine Rückstände und Gerüche aus bisher getesteten Tieren, die vor jedem Test zu entfernen. Nach 5 min Gewöhnung Zeit werden die Bewegungen über eine 5 min Zeitrahmen erfasst. Beide contra-und ipsilateral Ganzkörper-Rotation werden gemessen und verglichen mit der Kontrollgruppe (Fahrzeug gespritzt). Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wurde, wird Kontrolltiere zeigen keine Drehung, während 6-OHDA lädierten Tieren beginnt Hinwendung zu der kontralateralen Seite, da die Agonisten vorwiegend aktiviert die hochempfindliche denervierten Striatum auf der lädierten Seite. Tiere Scoring über 7 min (Anzeige mindestens 7 Ganzkörper-kontralateralen Umdrehungen pro Minute) gelten als erfolgreich lädierten. Das Tier kann sicher ans Gehäuse 30 min nach dem Test, die wöchentlich wiederholt werden können zurückgegeben werden. In unseren Händen, erscheint weniger als 5% der verletzten Mäuse suboptimal Drehraten.
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Discussion
Umfangreiche einseitige Läsion des nigro-striatalen Bahn zuverlässig bei Mäusen erzielt werden durch eine einzige stereotaktische Injektion von 6-OHDA in das Striatum. Die Ausdehnung der Läsion kann post-mortem durch Immunhistochemie nachgewiesen werden für Tyrosinhydroxylase (was katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Synthese von DA, dh die Umwandlung von L-Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin), wie in dem Video dargestellt.
In vivo sind kontralateralen Rotationen durch Apomorphin induzierte eine bessere Vorhersage der maximalen striatalen Läsion als Amphetamin-induzierten ipsilaterale Rotation 8. So können funktionelle Konsequenzen der Läsion über mehrere Monate durch eine einfache Messung von Apomorphin-induzierten kontralateralen Rotationen überwacht werden.
Die Erfolgsquote liegt bei etwa 95%. Es ist deutlich höher als das, was ist in der Regel für Ratten (50-70%), in denen umfangreiche dopaminergen Depletion erfordert ein Vielfaches Injektionen des Neurotoxin und erhöht die Sterberate gemeldet. In Mäusen, sollte experimentellen Bedingungen standardisiert werden, indem Sie Tiere passenden Gewicht, und nur mit frisch zubereiteten 6-OHDA-Lösung. Obwohl auch andere Gruppen unterschiedlicher Konzentration und / oder Volumina Neurotoxin nutzen können, haben wir festgestellt, dass 2 ml einer 5 mg / ml Kochsalzlösung von 6-OHDA (mit 0,02% Ascorbinsäure zur Verhinderung von Oxidation) die effizienteste für maximal Läsion wurden. Alternativ könnte submaximalen Injektionen nützlich sein, um die fortschreitende Degeneration von dopaminergen Terminals, die in den Menschen, vor allem in Jugend-und early-onset Formen der PD 9 erfolgt zu imitieren.
MPTP Läsionen können zu spontaner Heilung führen, und zusätzlich ist auf Geschlecht, Alter und Belastung. Eine aktuelle Studie zeigt, dass dies nicht der Fall ist für 6-OHDA Läsionen in Mäusen, die massive und lang anhaltende Senkung der Rest-DA Inhalt Ertrag im Striatum sowie in der Anzahl der TH-positiven Zellen in der Substantia nigra in allen Mäusen getestet 10.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt, die 6-Hydroxydopamin Läsion Modell der Parkinson - die wurde ausgiebig für 40 Jahre bei Ratten verwendet - kann zuverlässig auf Mäuse übertragen werden. Wir hoffen, dass dieses Video wird hilfreich sein, um andere Gruppen, und somit die Verringerung der Anzahl von Experimenten und Tieren für die präklinische Forschung auf neue zelluläre Therapien für PD 11 benötigt.
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Disclosures
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung der Säugetiere in Neuroscience and Behavior Forschung durchgeführt
Acknowledgments
Unterstützt von Fundação de Amparo ein Fortgeschrittenen-do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Wir bedanken uns bei anonymen Gutachtern, deren Kommentare dazu beigetragen, uns zu verbessern sowohl das Manuskript und Video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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