Summary
מחלת פרקינסון נגרמת על ידי אובדן של העצבוב דופאמין אל הסטריאטום, אשר יכול להיגרם בניסוי על ידי 6 דופמין-OH. אנו מתארים כיצד לבצע הנגע stereotaxic כדי לפקח הידרוכלורידי-Induced התנהגות הסיבוב בעכברים. מודל זה שימושי ואמין לבדיקה טיפולים חדשים למחלת פרקינסון.
Abstract
מחלת הפרקינסון (PD) משפיע על לפחות 6,500,000 בני אדם ברחבי העולם, ללא הבדל מין, גבולות חברתיים, כלכליים או גיאוגרפיים. תסמינים עיקריים, כגון קשיחות רעד, ו bradikinesia, לפתח כאשר כ 3 / 4 של תאים דופאמינרגיים יאבדו את nigra substantia, ולא מצליחים לספק להסדרת חלקה ומתואמת של מעגלים מנוע striatal. דיכאון הזיות נפוצים, ודמנציה בסופו של דבר מתרחשת אצל 20% מהחולים. בשלב זה, אין טיפול לעכב או לעצור את ההתקדמות של מחלת הפרקינסון. במקום זאת, תרופות המטרה זמין כרגע יותר לכיוון להקל על תסמינים אלו. אסטרטגיות כירורגית ניו הפיך עשוי לעבור על מעגלים פגום מבחינה תפקודית באמצעות גירוי חשמלי של מבנים מוחיים עמוקים, אך למרות גירוי מוחי עמוק הוא התקדמות גדולה, זה לא מתאים לכל החולים. נותר אפוא צורך לבחון גישות חדשות בטיפול תא במודלים פרה.
שיבוש neurotoxic סלקטיבי של מסלולים דופאמין ניתן לשחזר על ידי הזרקה של hydroxydopamine-6 (6 OHDA) או MPTP (1-methyl-4-פניל-1-,2,3,6 tertahydropyridine) ואילו depleting סמים חמצוני מזיק כימיקלים עשויה גם להתרבות תכונות ספציפיות של פ"ד במכרסמים. בניגוד MPTP, 6-OHDA נגעים לגרום לאובדן מסיבי עצבי בלתי הפיך, והוא יכול להיות חד או דו צדדי. המודל 6-OHDA הנגע הוא אמין, מוביל גירעונות מנוע חזק, והיא הנפוצה ביותר rats1 לאחר 40 שנים של מחקר. כמו יחסי הגומלין בין תאים מורכבים מארח כעת ניתן ללמוד באופן יסודי יותר בעכברים מאשר בחולדות, המודל כבר משורבב ל 2,3 עכברים, בו התאפיינה לאחרונה 4.
בסרטון זה אנו מדגימים כיצד הנגע מסלול שמאל הכושי-striatal של עכברים הרדים ידי לאט ומספק 2.0 μL של 6-OHDA באמצעות מחט המזרק מוכנס מיקרו stereotaxically. ההפסד של דופאמין קלט מתרחשת בתוך ימים, ליקויי פונקציונלי יכול להיות פיקוח על שלאחר הניתוח שבועות וחודשים על ידי בעלי חיים סיבובים דירוג המושרה על ידי סוכני דופאמין 5. כאן, אנו מציגים גוף מלא סיבובים הנגדי המתרחשים 10 דקות לאחר מתן תת עורית אחת של הידרוכלורידי, נמדד כחודש לאחר הפגיעה. התוצאות והחסרונות נדונים להלן.
Protocol
כימיקלים כל מאוחסנים בצורת מוצק, כגון 6-OHDA ו הידרוכלורידי, היו מדולל במים מסוננים הזרקה סטרילי בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום. בנוסף, neurotoxins וחומרים neuroactive אוחסנו, מוכן, טיפל להיפטר פי התקנות שנקבעו על ידי הנחיות בינלאומיות 6 ו biosafety הוועדה המקומית.
1 - הרדמה וניתוח
למבוגרים עכברים השוויצרי גבר (25-30G) הם premedicated עם אטרופין (0.2 מ"ג / ק"ג, sc) כדי להפחית את הטון ואת מחנק הרדים אז עם זריקה intraperitoneal של קטמין (90-120 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) . חיה ממוקמת על משטח חימום מבוקר אלקטרונית (Insight) כדי להבטיח טמפרטורת הגוף נשמר 37 ° C, כמו אינדוקציה של הרגעה לוקח כמה דקות. רמת הרדמה נבדק לאורך ההליך על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה. מינון ההרדמה צריך להיות ajusted עבור כל זן / המושבה. בהתאם החיה ומשך הניתוח, מינונים נוספים של קטמין עשוי להיות נחוץ. אחרי זה, מי מלח (NaCl 0,9%) מוחל על שתי העיניים כדי להגן על קרניות מהתייבשות ולבדוק את העדר רפלקס למצמץ ברגע זה הראשון. הפרווה על הראש כולו מגולח עם גוזם כדי להבטיח את מגע מינימלי עם אזורים unsterile. הרדמה מקומית (Xylocaine) על הסורגים האוזן כדי למנוע סבל. רק פעם אחת נסיגה רפלקס למצמץ נעלמו, המציין את רמת ההרדמה היא עמוקה מספיק לניתוח (שלב 3), החיה ממוקם על מסגרת stereotaxic באמצעות הפה חתיכת וברים האוזן תוכנן במיוחד עבור מין זה (Insight). Positionated פעם, משחה ophthalmologic (Marca) מוחל על מנת להגן על העיניים חיה לאורך כל הניתוח. רק לאחר להיות בטוח כי בעיני מוגנים כראוי, ההליך להמשיך עם החיטוי של העור באזור הניתוח על ידי חזרה על שלושה יישומים של יוד povidone ואחריו אתנול 70%, באמצעות ספוגיות כותנה סטרילי אחרי, מיקום נכון של הסורגים האוזן מובטחת על ידי בדיקת תנועות הצידה של הראש (הראש לא צריך לזוז כדי להבטיח את הסורגים הם קבועים היטב). הנטייה dorsoventral נכונה של הראש יאומת מאוחר יותר, כאשר מתגלים סימני דרך הגולגולת. חתך sagittal (1.5 ס"מ) הוא עשה עם אזמל סטרילי (# 15 להב). Periosteum על פני שטח של עניין הוא שרט בעדינות עם להב חדש, העצם נמחק במבט סטרילי ספוגיות כותנה, כדי לחשוף ציוני דרך הגולגולת: גבחת מוגדרת כנקודת החיתוך של התפרים sagittal ו העטרה, בעוד למבדה היא נקודת החיתוך של תפר sagittal וקו בכושר הטוב ביותר עובר דרך חלקים על ימין ועל שמאל של תפר lambdoid. קצה של מחט התייחסות בציר אנכי הוא התביית הראשון גבחת, תחת בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, ולאחר מכן עבר כמו לגעת בנקודה למבדה. אם הראש ממוקם כראוי, למבדה צריכה להיות ברמה dorso-הגחון כמו גבחת, וציוני דרך שניהם צריכים להיות רחוקים ידי מ"מ 4.2 לאורך ציר rostro-הזנב. אם לא, האוזניים ברים nosepiece יש לשחרר ואת הראש מוטה בעדינות סביב ציר interaural, על מנת להשיג את המיקום הרצוי, המגדיר את "גולגולת שטוחה" התייחסות אמצעים stereotaxical. קצה המחט התייחסות ממוקם אז קואורדינטות הרצוי: קדמית, אחורית (AP 0.5 מ"מ) לרוחב (L -2.0 מ"מ, משמאל). המקום מסומן על הגולגולת חור קטן (בקוטר 1.2 מ"מ) נפתח עם קצת לקדוח מעוקרים, באמצעות פעולה לסירוגין, כדי למנוע החום באזור. שברי עצם מוסרים בזהירות עם מגרד שיניים ושטפה עם סטרילי NaCl 0.9% חם. מעוקר 5 μl המילטון מזרק (26s מד; בקוטר 0.47 מ"מ החיצוני) הוא טעון עם פתרון 6-OHDA (או ברכב לבעלי חיים שליטה) ו בציר אנכי המנגנון stereotaxic. קצה המחט (סוג 2 או 12 שפוע °) מוכנס לתוך החור ואז נפתחה, עד לגעת במשטח pial, כדי דטרמיניסטיות נקודת ההתייחסות של לתאם dorso-הגחון. לאחר דטרמיניסטיות זה לתאם, המחט יורדת לאט להגיע הקואורדינטות של בסטריאטום (AP: 0.5; L: -2.0 ו DV: מ"מ -3.0, מתחת לפני השטח pial 7). הפתרון 6-OHDA (10 מיקרוגרם 6-OHDA ב NaCl 0.9% עם חומצה אסקורבית 0.02%), אשר הוכנה מסוננים בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, והוא חייב להיות מוגן מפני אור על ידי רדיד אלומיניום לאורך ההליך, מוזרק אז קצב הזרימה של 0.1μL/min. עבור בעלי חיים שליטה, נפח שווה של כלי רכב (0.02% חומצה אסקורבית ו -0.9% NaCl במים סטריליים) מוזרק. לאחר μL כולו 2.0 כבר הזריק, המזרק נשמר מקום 5 דקות לפני שהם מאוד לאט חזר בו מן המוח, לא פחות מאשר 5 דקות. הגולגולת היא לנקות את החתך נסגר באמצעות תפרים # 6-0 ניילון (שלון). כדי לקחת תוספתטיפול נגד זיהום, משחה אנטיביוטית מקומית, כמו neomycin, ניתן להחיל על העור sutured. בעלי חיים יוסרו מן המסגרת, בהתחשב 0.5 מ"ל של תמיסת מלח (sc.) על מנת למנוע התייבשות, והמשיך חמים תחת השגחה צמודה עד להחלמה מלאה. הם שוכנו אז עם מזון כרצונך מים. משככי כאבים מתווסף בקבוק שתייה עבור היומיים הראשונים לאחר הניתוח (נתון ממוצע צריכת המים היומית של 5.5 מ"ל, ואת המינון המומלץ של איבופרופן 0.03 מ"ג / גרם של משקל גוף / יום; להוסיף 0,82 מ"ל של 20 מ"ג / mL איבופרופן-אבוט ההשעיה למים לשתייה 100 מ"ל). עכברים בדרך כלל להתאושש במהירות מן ההליך, נדודים והגעה עבור כדורי מזון, מים בקלות. בכל מקרה של אי נוחות נראית לעין, או כל סימן לזיהום, בעלי חיים צריכים להיות מורדמים בהתאם להנחיות המקומיות.
2 - מבחן ההתנהגות
למרות פגיעה מוטורית ניתן לראות אחרי שבוע, מרווח שלאחר הנגע של חודש אחד מותר לפני כימות אמין במבחן הסיבוב. חיים מקבל זריקה תת עורית של הידרוכלורידי אגוניסט התובע (0.5 מ"ג / ק"ג), והוא ממוקם אטום של גליל בקוטר 30 ס"מ, 45 ס"מ מתחת להציב מצלמה ההקלטה. חשוב להסיר שאריות וריחות מחיות נבדק קודם לכן לפני כל בדיקה. לאחר תקופת התרגלות 5 דקות, התנועות נרשמות על פרק זמן 5 דקות. קונטרה ו סיבוב שני ipsilateral גוף מלא נמדדים בהשוואה לקבוצת הביקורת (הרכב מוזרק). אם ההליך בוצע כהלכה, חיות בקרת לא יציגו כל סיבוב, ואילו 6-OHDA חיות lesioned יתחיל להפוך לצד הנגדי, שכן אגוניסט בעיקר מפעיל את הסטריאטום denervated רגיש בצד lesioned. בעלי חיים ניקוד מעל 7 סל"ד (הצגת לפחות 7 גוף מלא הנגדי סיבובים לדקה) נחשבים lesioned בהצלחה. בעלי חיים ניתן חזרו בשלום שלהם 30 דקות דיור לאחר הבדיקה, אשר ניתן לחזור לשבוע. בידיים שלנו, פחות מ -5% של עכברים lesioned מוצגים שיעורי הסיבוב הכי מוצלח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנגע חד צדדית נרחבת של מסלול הכושי-striatal יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת אמין stereotaxic יחיד של 6-OHDA לתוך בסטריאטום בעכברים. היקף הפגיעה ניתן לאמת שלאחר המוות ע"י אימונוהיסטוכימיה עבור hydroxylase טירוזין (אשר catalyses שיעור הגבלת שלב של הסינתזה של התובע, כלומר המרה של L-tyrosine כדי dihydroxyphenylalanine), כפי שמודגם בסרטון.
בשנת vivo, סיבובים הנגדי המושרה על ידי הידרוכלורידי הם מנבא טוב יותר של הנגע striatal מקסימלי מאשר סיבוב אמפטמין-Induced ipsilateral 8. לפיכך, השלכות תפקודיות של הנגע יכול להיות במעקב במשך כמה חודשים על ידי מדידה ישירה של הידרוכלורידי-Induced סיבובים הנגדי.
שיעור ההצלחה הוא כ 95%. זה גבוה באופן משמעותי מאשר מה שדווח בדרך כלל חולדות (50-70%) בהם דלדול הדופמין נרחב דורש זריקות בכפולות של עצבי ומגדיל את שיעור התמותה. בעכברים, תנאי הניסוי צריך להיות אחיד על ידי בחירת החיות של התאמת משקל, ורק באמצעות המוכן טרי 6-OHDA פתרון. למרות קבוצות אחרות עשויים להשתמש ריכוז שונים ו / או כרכים של עצבים, מצאנו כי 2 מ"ל של פתרון מ"ג / 5 מ"ל של תמיסת מלח 6 OHDA (המכיל חומצה אסקורבית 0.02% על מנת למנוע חמצון) היו היעילה ביותר עבור פגיעה מירבית. לחלופין, זריקות submaximal יכול להיות שימושי לחקות את ניוון הדרגתי של מסופי דופאמין המתרחשת אצל בני אדם, במיוחד בצורות נעורים התפתחות מוקדמת של מחלת הפרקינסון 9.
נגעים MPTP עלולה להוביל החלמה ספונטנית, ובנוסף הוא רגיש מגדר, גיל, ומסננים. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי זה אינו המקרה במשך 6-OHDA נגעים בעכברים, אשר להניב הפחתות מסיבי מתמשך וארוך בתוכן התובע שיורית בתוך בסטריאטום, כמו גם במספר תאים חיובי TH ב nigra substantia בכל עכברים שנבדקו 10.
נכון לעכשיו, המודל 6-hydroxydopamine הנגע של פרקינסון - אשר כבר בשימוש נרחב במשך 40 שנה אצל חולדות -, יכול להיות משורבב אמין לעכברים. אנו מקווים כי וידאו זה יהיה מועיל לקבוצות אחרות, ובכך להפחית את מספר הניסויים בבעלי חיים דרוש מחקר קליני על טיפולים חדשים עבור הסלולר פ"ד 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומי לטיפול ושימוש יונקים Neuroscience ומחקר התנהגות
Acknowledgments
נתמך על ידי Fundação דה Amparo Pesquisa לעשות Estado לעשות בריו דה ז'נרו (FAPERJ) ו Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico דואר Tecnológico (CNPq). אנו אסירי תודה לשופטים אלמוניים שהערותיו עזרו לנו לשפר את כתב היד ווידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
