Summary
Паркинсона болезнь вызвана потерей дофаминергических иннервации стриатума, которые могут быть экспериментально индуцированных 6-ОН-допамина. Мы опишем, как выполнять стереотаксической поражения и следить апоморфина вызванных вращательное поведение у мышей. Эта модель является полезным и надежным для тестирования новых методов лечения болезни Паркинсона.
Abstract
Болезнь Паркинсона (БП) влияет не менее 6,5 миллиона человек по всему миру, независимо от пола, социальных, этнических, экономических или географических границ. Основные симптомы, такие как тремор, ригидность и bradikinesia, развиваться, когда около 3 / 4 дофаминергических клетки теряются в черной субстанции, а не обеспечить гладкий, скоординированного регулирования полосатой схем двигателя. Депрессия и галлюцинации являются общими, и слабоумие в конечном итоге происходит у 20% пациентов. В настоящее время нет лечения, чтобы задержать или остановить прогрессирование БП. Скорее всего, препараты в настоящее время цель в большей степени на смягчение этих симптомов. Новые хирургические методы могут обратимо включить функционально поврежденных цепей посредством электрической стимуляции глубоких структур головного мозга, но, хотя глубокая стимуляция мозга является важным шагом вперед, он не подходит для всех пациентов. Остается поэтому необходимо апробировать новые подходы клеточной терапии в доклинических моделях.
Селективный нейротоксическое нарушение дофаминергических путей могут быть воспроизведены с помощью инъекций 6-hydroxydopamine (6-OHDA) или МФТП (1-метил-4-фенил-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), тогда как разрушающие лекарства и окислительно-вредных веществ может также воспроизводить особенности PD у грызунов. В отличие от МФТП, 6-OHDA поражения вызывают массовые необратимой потерей нейронов, и может быть одно-или двусторонним. 6-OHDA поражения модель является надежным, приводит к дефициту надежный двигатель, и является наиболее широко используемым после 40 лет исследований в rats1. Как взаимодействий между трансплантированных клеток и принимающих теперь могут быть изучены более тщательно на мышах, а не на крысах, модель была перенесена на мышах 2,3, где он был недавно характеризуется 4.
В этом видео, мы показали, как поражение левой Нигро-полосатой путь анестезии мышей медленно доставки 2,0 мкл 6-OHDA через stereotaxically вставляется микро-иглы шприца. Потеря дофаминергических ввод происходит в течение нескольких дней, и функциональных нарушений можно наблюдать за послеоперационной недели и месяцы, по рейтингу животных вращения индуцированной агентами дофаминергических 5. Здесь мы покажем, всего тела контралатеральной повороты происходят через 10 минут после однократного введения подкожного апоморфина, измеренное через месяц после поражения. Результаты и недостатки будут рассмотрены ниже.
Protocol
Все химические вещества, хранящиеся в твердой форме, например, 6-OHDA и апоморфин, разводили в стерильном закачки воды и фильтруют в ламинарном боксе, чтобы избежать загрязнения. Кроме того, нейротоксинов и нейроактивные вещества хранились, подготовленный, обходиться в соответствии с правилами, установленными международными директивами 6 и местных биобезопасности комитета.
1 - Анестезия и хирургия
Взрослый самец швейцарских мышей (25-30г) являются премедикацию атропином (0,2 мг / кг, подкожно) для снижения тонуса блуждающего нерва, а затем под наркозом с внутрибрюшинного введения кетамина (90-120 мг / кг) и Ксилазин (10 мг / кг) . Животное помещают на электронное управление грелку (Insight), чтобы обеспечить температуру тела поддерживается на уровне 37 ° С, а индукция седации занимает несколько минут. Анестезии уровня проверяется в течение всей процедуры, проверяя отсутствие вывода рефлекс. Анестетики доза должна быть скорректированы для каждого штамма / колонии. В зависимости от животного и продолжительности операции, дополнительные дозы кетамина может быть необходимым. После этого физиологического раствора (NaCl 0,9%) наносится на оба глаза, чтобы защитить роговицу от высыхания и тест отсутствие закрытием век в этот первый момент. Мех по всему голова бритая с триммером, чтобы обеспечить минимальный контакт с нестерильных областей. Местный анестетик (Xylocaine) применяется к уху баров, чтобы предотвратить дискомфорт. Только после отмены и закрытием век исчезли, что указывает на уровень анестезии достаточно глубок для хирургии (стадия 3), животное находится на стереотаксической раме с помощью рта кусок уха и баров, специально предназначенных для этого вида (Insight). После positionated, офтальмологические мази (MARCA) применяется для защиты животных глазах всей операции. Только после того, убедитесь, что глаза правильно защищен, процедуру продолжать дезинфекции кожи операционного региона, повторяя три применения повидон йод затем 70% этанола, используя стерильные тампоны хлопка После, правильное размещение ухо баров обеспечивается тестирование на боковых движений головы (голова не должна двигаться, чтобы бары надежно фиксированы). Правильное дорсовентральной наклон головы будут проверены позже, когда череп ориентиры выявлено. Сагиттальный разрез (1,5 см) производится стерильным скальпелем (# 15 лезвие). Надкостницы над сферой интересов мягко разгреб с нового диска и кости протереть стерильной взглядом и ватные тампоны, чтобы раскрыть черепа ориентиров: брегмы определяется как точка пересечения сагиттальной и корональной швов, в то время как лямбда является точкой пересечения стреловидного шва и наилучшим образом соответствует линии, проходящей через левую и правую части ламбдовидный шва. Кончик вертикально ссылкой игла первый обнуляется на темя, рассматриваемых через операционный микроскоп, а затем перешел, как прикоснуться к точке лямбда. Если руководитель правильно расположен, лямбда должна быть в то же дорзо-вентральной уровне, что и темя, и оба ориентиры должны быть далеким от 4,2 мм вдоль rostro-каудальной оси. Если нет, то уши баров и револьвер должны ослабить и голова наклонена деликатно вокруг interaural оси, для достижения желаемого положения, которое определяет "плоский череп" ведения stereotaxical мер. Кончике иглы ссылкой затем позиционируется на нужную координаты: передне-задней (AP 0,5 мм) и боковой (L -2,0 мм, слева). Местоположение отмечено на череп и маленький (1,2 мм в диаметре) отверстие открывается стерилизовать сверло, с помощью прерывистого действия для предотвращения тепла области. Костные фрагменты осторожно удаляются с зубной кюретки и промывают теплой стерильной 0,9% NaCl. Стерилизовать 5 мкл Hamilton шприц (26s датчика; 0,47 мм наружный диаметр) загружается с 6-OHDA решение (или транспортного средства для контроля животных) и вертикально в стереотаксического аппарата. Кончик иглы (тип 2 или 12 ° скос) затем вставляется в отверстие открыто, на ощупь мягкой мозговой оболочки поверхности, чтобы обозначить точку отсчета дорзо-вентральной координат. После этого определенные координаты, игла медленно опустил достичь координат стриатума (AP: 0,5; L: -2,0 и DV: -3,0 мм ниже поверхности пиальных 7). 6-OHDA решения (10 мкг 6-OHDA в 0,9% NaCl с 0,02% аскорбиновой кислоты), который был подготовлен и фильтруются в ламинарном боксе, и должны быть защищены от света алюминиевой фольги на протяжении всей процедуры, затем вводится в Расход 0.1μL/min. Для контрольных животных, равного объема транспортного средства (0,02% аскорбиновой кислоты и 0,9% NaCl в стерильной воде) вводится. После всего 2,0 мкл были введены, шприц оставаться на месте в течение 5 минут, прежде чем очень медленно отказался от мозга, не менее чем за 5 минут. Череп очищается и разрез закрыт с помощью # 6-0 нейлона шва (Шалон). Чтобы воспользоваться дополнительнымиуход от инфекции, местного мазь с антибиотиком, например, неомицин, могут быть применены к зашивается кожи. Животные будут удалены из кадра, учитывая 0,5 мл физиологического раствора (sc.), чтобы предотвратить обезвоживание и тепле и под тщательным наблюдением до полного выздоровления. Затем они размещались с пищей и водой без ограничений объявление. Болеутоляющие добавляется в бутылке питьевой воды в течение первых двух дней после операции (при условии, среднесуточное потребление воды в 5,5 мл, а рекомендуемая дозировка 0,03 Ибупрофен мг / г веса тела / день, добавить 0,82 мл 20 мг / мл ибупрофен-Abbott подвески до 100 мл питьевой воды). Мыши обычно выздоравливают быстро от процедуры, блуждая и тянется за гранулы водой пища легко. В любом случае очевидного дискомфорта или каких-либо признаков инфекции, животные должны быть умерщвлены в соответствии с местными руководящими принципами.
2 - Поведенческий тест
Хотя двигательными нарушениями можно наблюдать через неделю, после поражения интервалом в один месяц, прежде чем позволил надежных количественных с вращением тест. Животное получает подкожного введения агониста апоморфина DA (0,5 мг / кг), и помещается в непрозрачный цилиндр диаметром 30 см, помещенный 45 см ниже записи камеры. Важно, чтобы удалить остатки и запахов от ранее исследованных животных перед каждым испытанием. После 5 минут привыкания период движения зарегистрировано более 5 мин сроки. Оба контра-и ипсилатеральной всего тела вращения измеряются и по сравнению с контрольной группой (транспортное средство вводится). Если процедура была выполнена правильно, контрольные животные не проявляют какие-либо вращения, в то время как 6-OHDA пораженном животные начнут переходить к противоположной стороне, так как агонист преимущественно активирует сверхчувствительной денервированных стриатума на пораженном стороне. Животные забив в течение 7 мин (отображение по меньшей мере 7 всего тела контралатеральной оборотов в минуту) рассматриваются так же успешно, пораженном. Животное может быть благополучно вернулись к своим жильем через 30 минут после теста, который может быть повторен в неделю. В наших руках, менее 5% от пораженном мышей отображается субоптимальные скорости вращения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обширные одностороннем поражении Нигро-полосатой пути может быть достигнуто надежно у мышей одной стереотаксической инъекции 6-OHDA в полосатом теле. Степень поражения может быть проверена посмертного по иммуногистохимии для тирозингидроксилазы (которая катализирует скорость лимитирующей стадии синтеза ДА, то есть преобразование L-тирозин, чтобы диоксифенилаланина), как показано на видео.
В естественных условиях, контралатеральной вращения индуцированных апоморфин являются лучшим индикатором максимального полосатой поражения, чем амфетамин вызванных ипсилатерального вращения 8. Таким образом, функциональные последствия поражения можно наблюдать в течение нескольких месяцев просто мера апоморфина вызванных контралатеральной вращений.
Шанс около 95%. Это значительно выше, чем то, что, как правило, сообщали для крыс (50-70%), в котором обширное дофаминергических истощения требует кратность инъекций нейротоксина и увеличивает смертность. У мышей, условия эксперимента должны быть стандартизированы, выбрав животных соответствия веса, и только с использованием свежеприготовленных 6-OHDA решение. Хотя другие группы могут использовать различные концентрации и / или объемов нейротоксин, мы обнаружили, что 2 мл 5 мг / мл физиологического раствора 6-OHDA (содержащих 0,02% аскорбиновой кислоты для предотвращения окисления) были наиболее эффективными для максимального поражения. Кроме того, субмаксимальной инъекции могут быть полезны, чтобы имитировать прогрессивную дегенерацию дофаминергических терминалов, который происходит в организме человека, особенно в отношении несовершеннолетних и ранним началом формы ПД 9.
МФТП поражениях, может привести к спонтанному восстановлению, а кроме того, чувствительны к полу, возрасту, и процедить. Недавнее исследование показывает, что это не относится к 6-OHDA повреждений у мышей, которые дают массовый и длительный снижение остаточного содержания DA в полосатом теле, а также в число TH-положительных клеток в черной субстанции во всех мышах испытания 10.
В настоящее время, 6-hydroxydopamine поражения моделью болезни Паркинсона - который широко использовался в течение 40 лет у крыс -, может быть надежно перенесены на мышах. Мы надеемся, что это видео будет полезно для других групп, и тем самым сократить количество экспериментов и животных, необходимых для доклинических исследований новых клеточной терапии для PD 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты проводились в соответствии с международными Руководство по уходу и использованию млекопитающих в неврологии и поведения исследований
Acknowledgments
Поддержка Fundação де Ампаро Pesquisa сделать Estado-ду-Риу-де-Жанейро (FAPERJ) и Conselho Насьональ де Desenvolvimento Científico электронной Tecnológico (CNPq). Мы благодарны анонимным рецензентам, чьи комментарии помогли нам улучшить как рукопись и видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
- Ungerstedt, U. 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).
- Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease. J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).
- Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).
- Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., Höglinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice. Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).
- Ungerstedt, U. 6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome. Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).
- Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , National Academies Press. Comissão de Biosegurança, CCS-UFRJ. 209 (2003).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
- Hudson, J. L., Horne, C. G. van, Strömberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res. , 626-6167 (1993).
- Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions. Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).
- Isacson, O. Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease. JoVE. 3, (2007).
