Summary
Doença de Parkinson é causada pela perda da inervação dopaminérgica para o estriado, que pode ser induzida experimentalmente por 6-OH-dopamina. Descrevemos como executar uma lesão estereotáxica e monitorar induzida por apomorfina comportamento rotacional em camundongos. Este modelo é útil e confiável para testes de novas terapias para a doença de Parkinson.
Abstract
Doença de Parkinson (PD) afeta pelo menos 6,5 milhões de pessoas em todo o mundo, independentemente do sexo, as fronteiras sociais, étnicas, econômicas ou geográficas. Principais sintomas, como rigidez, tremor e bradikinesia, desenvolver-se quando cerca de 3 / 4 de células dopaminérgicas são perdidos na substância negra, e não conseguem prever o regulamento, suave coordenada dos circuitos motores estriatal. Depressão e alucinações são comuns, e demência, eventualmente, ocorre em 20% dos pacientes. Neste momento, não existe um tratamento para retardar ou parar a progressão da DP. Pelo contrário, o objectivo do medicações atualmente disponíveis mais para o alívio destes sintomas. Novas estratégias cirúrgicas podem reversivelmente ligar os circuitos danificados funcionalmente através da estimulação elétrica de estruturas cerebrais profundas, mas apesar de estimulação profunda do cérebro é um grande avanço, não é adequado para todos os pacientes. Permanece, portanto, necessário para testar abordagens nova terapia celular em modelos pré-clínicos.
Perturbações neurotóxicas seletiva de vias dopaminérgicas podem ser reproduzidas pela injeção de 6 hidroxidopamina (6-OHDA) ou MPTP (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), enquanto esgotando drogas e produtos químicos prejudiciais à oxidativo pode também reproduzir características específicas de PD em roedores. Ao contrário de MPTP, 6-OHDA lesões causar perda irreversível maciça neuronal, e podem ser uni ou bilateral. O modelo de lesão 6-OHDA é de confiança, leva ao déficit motor robusto, e é o mais amplamente utilizado após 40 anos de pesquisa em rats1. Como as interações entre as células enxertadas e host pode agora ser estudado mais profundamente em ratos e não em ratos, o modelo foi transposto para 2,3 camundongos, onde foi recentemente caracterizada 4.
Neste vídeo, demonstramos como a lesão da via Nigro-estriatal esquerda de ratos anestesiados por lentamente entregando 2,0 mL de 6-OHDA através de uma agulha inserida stereotaxically micro-seringa. A perda da entrada dopaminérgica ocorre dentro de dias, e as deficiências funcionais podem ser monitorados ao longo do pós-operatório semanas e meses por rotações de classificação de animais induzida por agentes dopaminérgicos 5. Aqui, vamos mostrar de corpo inteiro rotações contralateral ocorre 10 minutos após uma única administração subcutânea da apomorfina, medido um mês após a lesão. Resultados e as desvantagens são discutidas abaixo.
Protocol
Todos os produtos químicos armazenados na forma sólida, como 6-OHDA e apomorfina, foram diluídos em água de injeção estéril e filtrado dentro de uma capela de fluxo laminar, para evitar a contaminação. Além disso, neurotoxinas e substâncias neuroactive foram armazenados, preparados, manipulados e eliminados de acordo com normas estabelecidas pelas diretrizes internacionais 6 e os locais de Biossegurança.
1 - A anestesia e cirurgia
Adulto masculino camundongos suíços (25-30g) são pré-medicados com Atropina (0,2 mg / Kg, sc) para reduzir o tônus vagal e anestesiados com injeção intraperitoneal de ketamina (90-120 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg) . O animal é colocado sobre uma almofada de aquecimento controlada eletronicamente (Insight) para garantir a temperatura corporal é mantida a 37 ° C, como indução de sedação leva alguns minutos. O nível de anestesia é verificada em todo o processo por meio de testes a ausência de reflexo de retirada. Da dose do anestésico deve ser Ajustado para cada cepa / colônia. Dependendo do animal e da duração da cirurgia, doses adicionais de Ketamina pode ser necessária. Depois disso, a solução salina (NaCl 0,9%) é aplicado em ambos os olhos para proteger a córnea de secar e testar a ausência do reflexo de pestanejo neste primeiro momento. A pele toda a cabeça é raspada com um trimmer para garantir o mínimo contato com áreas não estéreis. Anestésico local (xilocaína) é aplicado às barras de ouvido para evitar desconforto. Apenas uma vez retirada e reflexo de pestanejo desapareceram, indicando o nível de anestesia é profundo o suficiente para a cirurgia (fase 3), o animal é posicionado sobre a armação estereotáxica utilizando bocal e bares ouvido especialmente concebidos para esta espécie (Insight). Uma vez positionated, uma pomada oftalmológica (MARCA) é aplicada para proteger os olhos dos animais em toda a cirurgia. Somente após ter certeza de que os olhos estão corretamente protegidos, o procedimento continuará com a desinfecção da pele da região cirúrgica, repetindo três aplicações de iodopovidona seguido por etanol 70%, com auxílio de swab estéril algodões Depois, a colocação correta das barras ouvido é assegurada através de testes de movimentos laterais da cabeça (a cabeça não deve mover-se para garantir que os bares estão firmemente fixos). Inclinação dorsoventral adequada da cabeça será verificado mais tarde quando marcos crânio são revelados. Uma incisão sagital (1,5 cm) é feita com um bisturi estéril (# lâmina 15). O periósteo sobre a área de interesse é cuidadosamente raspado afastado com uma lâmina nova, e osso é limpo com o olhar estéril e cotonetes, para descobrir marcos crânio: bregma é definido como o ponto de intersecção das suturas sagital e coronal, enquanto lambda é o ponto de interseção da sutura sagital ea linha de melhor ajuste passando as partes esquerda e direita da sutura lambdóide. A ponta de uma agulha de referência alinhados verticalmente é o primeiro zero no bregma, em análise através do microscópio cirúrgico, em seguida, mudou-se a tocar o ponto lambda. Se a cabeça está posicionada corretamente, lambda deve ser ao nível dorso-ventral mesma bregma, e ambos os marcos devem ser distantes de 4,2 milímetros ao longo do eixo rostro-caudal. Se não, as barras de orelhas e nosepiece deve ser soltar e delicadamente a cabeça inclinada em torno do eixo interaural, a fim de atingir a posição desejada, que define o "flat crânio" de referência para medidas stereotaxical. A ponta da agulha de referência é então posicionado nas coordenadas desejado: ântero-posterior (AP 0,5 milímetros) e lateral (L -2,0 mm, esquerda). O local é marcado no crânio e um buraco (1,2 mm de diâmetro) de pequeno porte é aberto com uma broca esterilizada, usando a ação intermitente para evitar o calor da região. Fragmentos de ossos são cuidadosamente removido com uma cureta odontológica estéril e lavadas com NaCl 0,9% morna. O esterilizados 5 mL Hamilton seringa (26s bitola, 0,47 mm de diâmetro externo) é carregado com a solução de 6-OHDA (ou veículo para animais do grupo controle) e alinhados verticalmente no aparelho estereotáxico. A ponta da agulha (tipo 2 ou 12 bisel °) é então inserido dentro do buraco aberto, até tocar a superfície pial, para determinar o ponto de referência da coordenada dorso-ventral. Uma vez determinada essa coordenada, a agulha é diminuída lentamente para atingir as coordenadas do striatum (AP: 0,5; L: -2,0 e DV: -3,0 mm, abaixo da superfície pial 7). A solução 6-OHDA (10 mg 6-OHDA em NaCl 0,9% com ácido ascórbico 0,02%), que foi preparada e filtrada dentro de uma capela de fluxo laminar, e deve ser protegido da luz por papel alumínio ao longo do processo, é então injetado no uma vazão de 0.1μL/min. Para os animais de controle, um volume igual de veículo (0,02% ácido ascórbico e 0,9% NaCl em água estéril) é injetado. Uma vez que o 2,0 mL inteira foi injetado, a seringa é mantida no lugar por 5 min antes de ser recolhido de forma muito lenta a partir do cérebro, em nada menos do que em 5 minutos. O crânio é limpo ea incisão é fechada com uma sutura # 6-0 nylon (Shalon). Para tirar um extracuidados contra a infecção, uma pomada antibiótica locais, como a neomicina, pode ser aplicado à pele suturada. Animais são retirados da moldura, dado 0,5 ml de solução salina (sc.) para evitar a desidratação, e manteve quente e sob observação até a recuperação completa. Em seguida, são alojados com alimentos e água ad libitum. Analgésico é adicionado à garrafa de água potável para os dois primeiros dias após a cirurgia (dado um consumo diário médio de 5,5 ml, e uma dose recomendada de ibuprofeno 0,03 mg / g de peso corporal / dia, adicionar 0,82 mL de 20 mg / mL de suspensão Ibuprofen-Abbott para 100 mL de água potável). Camundongos geralmente se recupera rapidamente a partir do procedimento, vagando e procurando pellets comida, água facilmente. Em qualquer caso de desconforto aparente, ou qualquer sinal de infecção, os animais devem ser sacrificados de acordo com as directrizes locais.
2 - teste comportamental
Embora deficiência motora podem ser observadas após uma semana, um intervalo de pós-lesão de um mês é permitido antes quantificação fiável com o teste de rotação. O animal recebe uma injeção subcutânea de apomorfina DA agonista (0,5 mg / Kg), e é colocado em um cilindro opaco de 30 cm de diâmetro, colocado 45 centímetros abaixo da câmera de gravação. É importante remover os resíduos e odores de animais previamente testados antes de cada teste. Depois de um período de habituação 5 min, os movimentos são registrados ao longo de um horizonte de 5 min. Ambos os contra-rotação e de corpo inteiro ipsilateral são medidos e comparados com o grupo controle (veículo injetado). Se o procedimento foi realizado corretamente, os animais de controle não apresenta qualquer rotação, enquanto que 6-OHDA animais lesionados vai começar a girar para o lado contralateral, uma vez que o agonista predominantemente ativa o striatum supersensível desnervados do lado lesionado. Animais marcar mais de 7 rpm (exibindo pelo menos 7 de corpo inteiro rotações por minuto contralateral) são considerados sucesso lesada. O animal pode ser seguramente retornado à sua moradia min 30 após o teste, que pode ser repetida semanalmente. Em nossas mãos, a menos de 5% dos ratos lesionados exibido taxas de rotação abaixo do ideal.
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Discussion
Extensa lesão unilateral da via Nigro-estriatal pode ser alcançado de forma confiável em camundongos por uma única injeção estereotáxica de 6-OHDA no striatum. A extensão da lesão pode ser verificado post-mortem por imuno-histoquímica para a tirosina hidroxilase (que catalisa a etapa limitante da taxa da síntese de DA, ou seja, a conversão de L-Tirosina para dihidroxifenilalanina), como ilustrado no vídeo.
In vivo, as rotações contralaterais induzidas por apomorfina é um melhor preditor de lesão estriatal máxima do que as anfetaminas induzida por rotação ipsilateral 8. Assim, as conseqüências funcionais da lesão pode ser monitorado durante vários meses por uma medida simples da apomorfina induzida rotações contralateral.
A taxa de sucesso é de cerca de 95%. É significativamente maior do que o que geralmente é relatado para ratos (50-70%), em que a depleção dopaminérgica extensa requer múltiplos injeções da neurotoxina e aumenta a taxa de mortalidade. Em camundongos, as condições experimentais devem ser padronizados, selecionando animais de correspondência de peso, e usando apenas acabada de preparar solução de 6-OHDA. Embora outros grupos podem usar diferentes concentrações e / ou volumes de neurotoxina, descobrimos que 2 ml de uma solução de 5 mg / ml solução salina de 6-OHDA (contendo ácido ascórbico 0,02% para evitar a oxidação) foram os mais eficientes para lesão máxima. Em alternativa, injeções submáximo poderia ser útil para imitar a degeneração progressiva dos terminais dopaminérgicos, que ocorre em seres humanos, especialmente nas formas juvenil e de início precoce da DP 9.
Lesões MPTP pode levar a recuperação espontânea, e, adicionalmente, é sensível a gênero, idade, e tensão. Um estudo recente indica que este não é o caso de 6-OHDA lesões em camundongos, que produzem em massa e redução longa duração no conteúdo DA residual dentro do striatum, bem como no número de células positivas TH na substância negra em todas as camundongos testados 10.
No presente momento, o modelo de lesão 6-hidroxidopamina de Parkinson - que tem sido amplamente utilizada por 40 anos em ratos -, pode ser confiavelmente transposta para ratos. Desejamos que este vídeo vai ser útil a outros grupos, e assim reduzir o número de experimentos e os animais necessários para a investigação pré-clínicos com novas terapias celulares para PD 11.
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Disclosures
Experimentos foram realizados em conformidade com as Diretrizes internacionais para o Cuidado e Uso de Mamíferos em Neurociências e Comportamento Pesquisa
Acknowledgments
Apoiado pela Fundação de Amparo Pesquisa um do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Somos gratos aos árbitros anônimos cujos comentários nos ajudaram a melhorar tanto o manuscrito e vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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