Summary
La enfermedad de Parkinson es causado por la pérdida de la inervación dopaminérgica en el cuerpo estriado, que puede ser inducida experimentalmente por 6-OH-dopamina. Se describe cómo realizar una lesión estereotáxica y controlar el comportamiento inducido por la apomorfina rotación en los ratones. Este modelo es útil y confiable para probar nuevas terapias para la enfermedad de Parkinson.
Abstract
La enfermedad de Parkinson (EP) afecta al menos a 6,5 millones de personas en todo el mundo, independientemente de su sexo, las fronteras sociales, étnicas, económicas o geográficas. Los síntomas principales, tales como temblor, rigidez y bradikinesia, se desarrollan cuando aproximadamente 3 / 4 de las células dopaminérgicas se pierden en la sustancia negra, y no pueden proporcionar para la regulación suave y coordinada de los circuitos motores del estriado. Depresión y alucinaciones son comunes, y la demencia con el tiempo ocurre en el 20% de los pacientes. En este momento, no existe un tratamiento para retrasar o detener la progresión de la EP. Por el contrario, los medicamentos disponibles en la actualidad más objetivo hacia el alivio de estos síntomas. Nuevas estrategias quirúrgicas reversible puede cambiar en los circuitos funcionalmente dañadas a través de la estimulación eléctrica de estructuras profundas del cerebro, pero a pesar de la estimulación cerebral profunda es un avance importante, no es adecuado para todos los pacientes. Queda, pues, necesario para probar nuevas estrategias de terapia celular en modelos preclínicos.
Interrupción selectiva neurotóxica de las vías dopaminérgicas pueden ser reproducidos por la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) o MPTP (1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tertahydropyridine), mientras que agotan los medicamentos y los productos químicos oxidantes que dañan puede También se reproducen las características específicas de la EP en los roedores. A diferencia de MPTP, 6-OHDA lesiones causan gran pérdida neuronal irreversible, y puede ser uni o bilateral. El modelo de lesión de 6-OHDA es confiable, da lugar a déficits motores robustos, y es el más utilizado después de 40 años de investigación en rats1. Como las interacciones entre las células injertadas y anfitrión puede ser estudiado más a fondo en los ratones y no en las ratas, el modelo ha sido adaptado a los ratones 2,3, donde recientemente se ha caracterizado 4.
En este video, que muestra cómo la lesión de la izquierda nigro-estriado vía de ratones anestesiados por la lenta entrega de 2,0 l de 6-OHDA a través de un stereotaxically inserta micro-aguja de la jeringa. La pérdida de la entrada dopaminérgica ocurre unos días después, y el deterioro funcional puede ser monitoreado en post-operatorio semanas y meses por las rotaciones de los animales calificación inducida por agentes dopaminérgicos 5. Aquí, se muestra de cuerpo entero la rotación contralateral ocurre 10 minutos después de una sola administración subcutánea de apomorfina, mide un mes después de la lesión. Los resultados y los inconvenientes se analizan a continuación.
Protocol
Todos los productos químicos almacenados en forma sólida, como la 6-OHDA y apomorfina, se diluye en el agua de inyección estéril y se filtra dentro de una campana de flujo laminar, para evitar la contaminación. Además, las neurotoxinas y sustancias neuroactivos fueron almacenados, preparados, manipulados y eliminados de acuerdo a la reglamentación establecida por las normas internacionales y seis locales de la Comisión de Seguridad de la Biotecnología.
1 - Anestesia y cirugía
Ratones machos adultos suizos (25-30g) son premedicados con atropina (0,2 mg / kg, sc) para reducir el tono vagal y anestesiados con una inyección intraperitoneal de ketamina (90-120 mg / kg) y xilazina (10 mg / Kg) . El animal se coloca en una almohadilla de calefacción con control electrónico (Insight) para asegurar la temperatura corporal se mantiene a 37 ° C, como la inducción de la sedación toma unos minutos. El nivel de anestesia se comprueba a través del procedimiento de prueba de la ausencia de reflejo de retirada. Dosis de anestesia debe ser ajustada para cada cepa / colonia. Dependiendo del animal y la duración de la cirugía, las dosis adicionales de ketamina puede ser necesario. Después de eso, la solución salina (NaCl 0,9%) se aplica en ambos ojos para proteger la córnea de la desecación y la prueba de la ausencia del reflejo de parpadeo en este primer momento. La piel en toda la cabeza se afeita con un condensador de ajuste para garantizar el mínimo contacto con zonas estériles. Anestésico local (xilocaína) se aplica a las barras del oído para evitar el malestar. Sólo una vez retirada y reflejo de parpadeo se han desvanecido, lo que indica el nivel de anestesia es lo suficientemente profunda para la cirugía (fase 3), el animal se coloca en el marco estereotáxico con boquilla y bares del oído especialmente diseñado para esta especie (Insight). Una vez positionated, una pomada oftalmológica (MARCA) se aplica para proteger los ojos de los animales a lo largo de toda la cirugía. Sólo después de asegurarse de que los ojos están correctamente protegidas, el procedimiento continuará con la desinfección de la piel de la región quirúrgica mediante la repetición de tres aplicaciones de yodo povidona seguido de 70% de etanol, utilizando hisopos de algodón estériles Después, correcta ubicación de las barras de oído es garantizada por las pruebas de movimientos laterales de la cabeza (la cabeza no debe moverse para que las barras estén bien fijos). Inclinación adecuada dorsoventral de la cabeza se verificará más adelante, cuando se revelan puntos de referencia del cráneo. Se hace una incisión sagital (1,5 cm) se hace con un bisturí estéril (# 15 hojas). El periostio sobre el área de interés se raspa suavemente lejos con una hoja nueva, y el hueso se limpia con la mirada estéril y bastoncillos de algodón, para descubrir puntos de referencia del cráneo: bregma se define como el punto de intersección de las suturas coronal y sagital, mientras que lambda es el punto de intersección de la sutura sagital y la línea de mejor ajuste que pasa por la parte izquierda y derecha de la sutura. La punta de una aguja de referencia alineada verticalmente por primera vez a cero en el bregma, que se examina en el microscopio quirúrgico, y luego se trasladó como tocar el punto lambda. Si la cabeza se coloca correctamente, lambda debe estar en el mismo nivel dorso-ventral como bregma, y ambos lugares, separados por 4,2 mm en el eje rostro-caudal. Si no, las barras de las orejas y el portaobjetos debe aflojar y la cabeza inclinada delicadamente alrededor del eje interaural, a fin de lograr la posición deseada, que define el "cráneo plano" de referencia para las medidas de stereotaxical. La punta de la aguja de referencia se sitúa en las coordenadas deseadas: antero-posterior (AP 0.5 mm) y lateral (L -2,0 mm, izquierda). La ubicación está marcada en el cráneo y un pequeño (1,2 mm de diámetro) el agujero se abrió con una broca de esterilización, el uso intermitente de la acción para evitar el calor de la zona. Fragmentos de hueso se retira cuidadosamente con un raspador dental y lavado con agua estéril tibia NaCl al 0,9%. La esterilización 5 l jeringa Hamilton (26s medidor, 0,47 mm de diámetro exterior) se carga con la solución de 6-OHDA (o el vehículo de los animales de control) y verticalmente en el aparato estereotáxico. La punta de la aguja (tipo 2 o 12 bisel °) se inserta en el agujero abierto, hasta que toque la superficie pial, para determinar el punto de referencia de la coordenada dorso-ventral. Una vez determinada esta coordenada, la aguja es reducida gradualmente para llegar a las coordenadas del cuerpo estriado (AP: 0,5; L: -2,0 y DV: -3,0 mm, debajo de la superficie pial 7). La solución de 6-OHDA (10 mg 6-OHDA en NaCl al 0,9% con ácido ascórbico 0,02%), que se preparó y se filtra dentro de una campana de flujo laminar, y debe ser protegido de la luz con papel de aluminio durante todo el procedimiento, se inyecta en un caudal de 0.1μL/min. Para los animales de control, un volumen igual de vehículo (ácido ascórbico 0,02% y el 0,9% de NaCl en agua estéril) se inyecta. Una vez que la totalidad de l 2.0 ha sido inyectado, la jeringa se mantiene en su lugar por 5 minutos antes de que se retrae muy lentamente desde el cerebro, en no menos que en 5 minutos. El cráneo se limpia y se cierra la incisión con una sutura de nylon # 6-0 (Shalon). Para tener un extraatención de las infecciones, un ungüento antibiótico local, como la neomicina, pueden ser aplicados a la piel suturada. Los animales son retirados de la estructura, dado 0,5 ml de solución salina (sc.) para prevenir la deshidratación, y se mantienen calientes y bajo una estrecha observación hasta la recuperación completa. Luego se encuentra con la comida y agua ad libitum. Analgésicos se añade a la botella de agua potable para los dos primeros días después de la cirugía (dado un consumo medio diario de agua de 5,5 ml, y una dosis recomendada de ibuprofeno 0,03 mg / g de peso corporal / día, añadir 0,82 ml de 20 mg / ml ibuprofeno Abbott suspensión de 100 ml de agua potable). Los ratones se recuperan rápidamente del procedimiento, errante y alcance de los pellets de alimentos el agua con facilidad. En cualquier caso de malestar evidente, o cualquier signo de infección, los animales deben ser sacrificados de acuerdo con las directrices locales.
2 - Ensayo de comportamiento
Aunque el deterioro del motor se puede observar después de una semana, un intervalo después de la lesión de un mes se permite antes de la cuantificación fiable con la prueba de rotación. El animal recibe una inyección subcutánea de apomorfina agonista DA (0,5 mg / Kg), y se coloca en un cilindro opaco de 30 cm de diámetro, colocados 45 cm por debajo de la grabación de la cámara. Es importante para eliminar los residuos y los olores de los animales previamente probados antes de cada prueba. Después de un periodo de habituación 5 minutos, los movimientos se registran en un plazo de 5 minutos. Ambas contra-y ipsilateral de todo el cuerpo de rotación se mide y se compara con el grupo control (vehículo de inyección). Si el procedimiento se realiza correctamente, los animales de control no se presenta ninguna rotación, mientras que la 6-OHDA animales lesionados comenzará a girar hacia el lado contralateral, ya que los agonistas predominantemente activa el cuerpo estriado denervado supersensible en el lado lesionado. Animales de puntuación de más de 7 rpm (que muestra por lo menos 7 de cuerpo entero rotaciones contralateral por minuto) son considerados como éxito lesionado. El animal puede ser regresado sano y salvo a su vivienda de 30 minutos después de la prueba, que puede repetirse semanalmente. En nuestras manos, menos del 5% de los ratones lesionados muestran las tasas de rotación óptimo.
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Discussion
Extensa lesión unilateral de la vía nigro-estriado se puede lograr de forma fiable en los ratones con una sola inyección estereotáxica de 6-OHDA en el estriado. La extensión de la lesión puede ser verificada post-mortem mediante técnicas de inmunohistoquímica para la tirosina hidroxilasa (que cataliza la etapa limitante de la velocidad de la síntesis de DA, es decir, la conversión de L-tirosina a dihidroxifenilalanina), como se muestra en el video.
In vivo, las rotaciones contralateral inducida por apomorfina es un mejor predictor de la lesión estriatal máxima que la anfetamina inducida por la rotación ipsilateral 8. Por lo tanto, las consecuencias funcionales de la lesión puede ser monitoreado durante varios meses por una medida directa de la inducida por la apomorfina rotación contralateral.
La tasa de éxito es del 95%. Es significativamente mayor que lo que generalmente se reporta para las ratas (50-70%) en el que el agotamiento dopaminérgicos extensa requiere inyecciones múltiples de la neurotoxina y aumenta la tasa de mortalidad. En los ratones, las condiciones experimentales deben ser normalizados mediante la selección de animales de igualar el peso, y sólo recién preparada con 6-OHDA solución. A pesar de que otros grupos pueden usar diferentes concentraciones y / o volúmenes de la neurotoxina, hemos encontrado que 2 ml de 5 mg / ml de solución salina de 6-OHDA (que contiene 0,02% de ácido ascórbico para prevenir la oxidación) fueron las más eficientes para la lesión del máximo. Por otra parte, las inyecciones de submáximo podría ser útil para simular la degeneración progresiva de los terminales dopaminérgicos que se produce en los seres humanos, especialmente en las formas juveniles y precoz de la EP 9.
Lesiones MPTP puede conducir a una recuperación espontánea, y, además, es sensible a género, edad, y la tensión. Un estudio reciente indica que este no es el caso de la 6-OHDA lesiones en los ratones, que producen una reducción duradera masiva y largo plazo en el contenido residual de DA en el cuerpo estriado, así como en el número de TH células positivas en la sustancia negra en todos los ratones estudiados 10.
En la actualidad, el modelo de lesión de 6-hidroxidopamina de Parkinson - que ha sido ampliamente utilizado desde hace 40 años en ratas -, puede ser incorporado de forma fiable a los ratones. Esperamos que este video será de utilidad a otros grupos, y con ello reducir el número de experimentos y de los animales necesarios para la investigación preclínica de nuevas terapias celulares para la EP 11.
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Disclosures
Los experimentos se realizaron en conformidad con las directrices internacionales para el cuidado y uso de los mamíferos en Neurociencias y de Investigación del Comportamiento
Acknowledgments
Con el apoyo de la Fundación de Amparo un Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) y Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Estamos muy agradecidos a los árbitros anónimos cuyos comentarios ayudaron a mejorar tanto el manuscrito y video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | König | 90-120 mg/Kg | |
| Xylazine hydrochloride | König | 10 mg/Kg | |
| Atropine Sulfate | Isofarma | Isofarma | |
| 6 – Hydroxydopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 5 μg/μL | |
| L - Ascorbic Acid | USB Corp., Affymetrix | 0.2% | |
| Xylocaine (Lidocaine Chloridrate) | AstraZeneca | 5% 50 mg |
|
| Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin) | Altana Pharma | 5 mg/g + 250 Ul/g | |
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg | |
| GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose | Novartis AG | 0.33% |
|
| Ibuprofen | Abbott Laboratories | 4 mg/ 100 ml drinking water | |
| Povidine | Johnson Diversey | ||
| R-(-)-Apomorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 0.5 mg/Kg |
References
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