מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.
Abstract
אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אחד או יותר; פסיפסים הם סוג אחד של הכימרה, שבו תאים גנוטיפ יותר מעורבים, בדרך כלל wild-type ו מוטציה. בשנת דג הזברה, מפלצות יכול להתבצע בקלות על ידי השתלה של תאים מעובר לעובר התורם מארח בשלב העוברי המתאים. תאים התורם תווית מופקים על ידי הזרקת סמן השושלת, כגון פלורסנט לצבוע, לעובר אחד תא הבמה. תאים התורם תווית יוסרו מעוברים התורם הוכנס עוברים לארח ללא תווית באמצעות נפט שבשליטת פיפטה זכוכית רכוב על תרכובת מיקרוסקופ או לנתח. תאים התורם יכול במקרים מסוימים להיות ממוקד לאזור ספציפי או רקמות של העובר המתפתח blastula או gastrula מארח שלב על ידי בחירת האתר השתלת העובר מארח מבוסס על ומבוססת מפות גורל.
Protocol
מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula. אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אח?…
Discussion
הקלות שבה השתלה ניתן להשתמש כדי לייצר מפלצות ממוקד היא אחת המעצמות הגדולות של דג הזברה כמודל החולייתנים. שינוי של פרוטוקול זה לא שתואר לעיל מאפשר ניתוח של תפקוד הגן האימהי עבור הגנים עם תפקידים חיוניים להתפתחות zygotic. מאחר דגים מוטנטים לא יכולים לשרוד עד לבגרות, יש צור…
Acknowledgements
תודה לחברי במעבדה Moens עבור קלט מועיל במהלך כתיבת מאמר זה. HK הוא פוסט דוקטורט נתמך על ידי NIH / NICHD מענק # 5R01HD037909-08. CBM הוא חוקר עם הווארד יוז רפואי במכון.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Injection rig
Applied Scientific Instrumentation
MPPI-3
Foot pedal can be ordered separately
Pronase
Sigma
P5147
“protease type XIV”
Pen-Strep
Sigma
P4458
100x stock
Methyl cellulose
Sigma
M-0387
Fluorescent dextrans
Molecular Probes/ Invitrogen
various
Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162)
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm)
Sutter
BF120-94-10
Transplant pipette option 1
World Precision Instruments
TW100-4
Transplant pipette option 2
VWR
#53508-400
micromanipulator
Narishige
UMJ-3FC (?)
Micromanipulator magnetic stand
Narishige
GJ-1
Transplant apparatus
Sutter Instrument Co.
MI-10010
Fine micromanipulator
Narishige
MMO-203
Depression slides
Fisher
12560A
Agar molds for injection and transplants
AL-AN Mfg, Inc.
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394, doi:10.3791/1394 (2009).