Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.
Un des outils les plus puissants utilisés pour mieux comprendre les processus complexes de développement est l'analyse des embryons chimériques. Une chimère est définie comme un organisme qui contient des cellules de plus d'un animal; mosaïques sont un type de chimère dans laquelle les cellules de plus d'un génotype sont mixtes, généralement de type sauvage et mutant. Dans le poisson zèbre, les chimères peuvent être facilement réalisés par transplantation de cellules d'un embryon donateurs dans un embryon hôte au stade approprié embryonnaire. Les cellules du donneur sont étiquetés produites par injection d'un marqueur de la lignée, comme un colorant fluorescent, dans l'embryon au stade d'une cellule. Les cellules du donneur sont étiquetés prélevées sur des embryons donateurs et introduit dans des embryons hôtes non étiquetés en utilisant une huile à commande pipette en verre montée sur un composé ou soit microscope à dissection. Les cellules donneuses peuvent dans certains cas, être ciblés sur une région spécifique ou un tissu de l'embryon en développement stade blastula ou gastrula d'hôte en choisissant un site de transplantation de l'embryon hôte basées sur des cartes sort bien établi.
La facilité avec laquelle la transplantation peuvent être utilisées pour produire des chimères ciblé est l'une des grandes puissances du poisson zèbre comme modèle vertébré. Une modification de ce protocole n'est pas décrit ci-dessus permet d'analyser la fonction des gènes maternels pour les gènes ayant un rôle essentiel dans le développement zygotique. Comme ces poissons mutants ne peuvent pas survivre jusqu'à l'âge adulte, il est nécessaire de transférer la lignée germinale dans …
Merci aux membres du laboratoire pour l'entrée Moens utiles lors de la rédaction de cet article. HK est stagiaire post-doctoral soutenu par le NIH / NICHD octroi # 5R01HD037909-08. CBM est un enquêteur de la Howard Hughes Medical Institute.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
Depression slides | Fisher | 12560A | ||
Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.