Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.
Karmaşık gelişim süreçlerini anlamak için kullanılan en güçlü araçlardan biri kimerik embriyoların analizidir. Chimera birden fazla hayvan hücreleri içeren bir organizma olarak tanımlanan mozaikler fazla bir genotip hücreleri genellikle yabani tip ve mutant, karışık olduğu bir tür kabus. Zebra balığı, kuruntulardan kolayca uygun embriyonik aşamada bir dizi embriyo bir donör embriyo hücrelerinin nakli yapılabilir. Etiketli donör hücreleri tek hücreli aşamada embriyo içine böyle bir floresan boya gibi bir soy işaretleyici, enjeksiyon yoluyla üretilir. Etiketli donör hücreler donör embriyolar kaldırılır ve bir bileşik veya diseksiyon mikroskop üzerine monte edilmiş bir yağ kontrollü cam pipet kullanarak etiketsiz ana embriyolara tanıtıldı. Donör hücreleri, bazı durumlarda, belirli bir bölge ya da gelişmekte olan blastula veya gastrula aşamada ana embriyo doku köklü kaderi haritalar dayalı ev sahibi embriyo nakli sitesi seçerek hedefli olabilir.
Transplantasyon hedeflenen kimeralar üretmek için kullanılabilir olan kolaylığı zebrafish omurgalı bir model olarak büyük güçlerin biridir. Yukarıda anlatılan bu protokol bir değişiklik Zigotik gelişiminde önemli rolleri olan genler için anne gen fonksiyonu analizi sağlar. Bu mutant balık yetişkinliğe kadar hayatta kalamaz bu yana, mutant hücreler "germline klonlar", bir başka vahşi tip konak embriyo mutant germline aktarmak için gereklidir. Yaratma germline mozaikler mutant bir donö…
Bu makalenin yazımı sırasında yararlı giriş için Moens laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. HK, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NICHD hibe # 5R01HD037909-08 tarafından desteklenen post-doktora araştırmacısı. CBM Howard Hughes Tıp Enstitüsü ile bir araştırmacı.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
Depression slides | Fisher | 12560A | ||
Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.