Summary
Den Stemgent Dox inducerbara mus TF lentivirus Set kan programmera om musen embryonala fibroblaster (MEFs) till inducerad (IPS) pluripotenta stamceller. Här kan vi visa protokollet för DOX-inducerbara uttryck för musen omprogrammering transkriptionsfaktorer Oct4 till Sox2, Klf4 och c-Myc skapa iPS kolonier som uttrycker gemensamma MES pluripotens markörer.
Abstract
Med hjälp av en definierad uppsättning transkriptionsfaktorer och cell villkor kultur, Yamanaka och kollegor visade att retrovirus-medierad leverans och uttryck Oct4, Sox2, c-Myc och Klf4 kan förmå pluripotens på musfibroblaster. 1 Påföljande rapporter har visat på nyttan av doxycyklin (DOX) inducerbara Lentiviral leverans system för generering av både primära och sekundära iPS-celler från en mängd andra somatiska vuxen mus celltyper. 2,3
Inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler liknar embryonala stamceller (ES-celler) i morfologi, spridning och förmåga att inducera teratom bildas. Båda typerna av celler kan användas som pluripotenta utgångsmaterial för produktion av differentierade celler eller vävnader i regenerativ medicin. 4-6 iPS-celler har också en klar fördel framför ES-celler som de uppvisar viktiga egenskaper hos ES-celler utan det etiska dilemmat embryot förstörs.
Här kan vi visa protokollet för omprogrammering möss embryonala fibroblaster (MEF) celler med Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus Set. Vi visar också att Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus Set är i stånd att uttrycka de fyra transkriptionsfaktorer vid transduktion i MEFs därmed inducera en pluripotenta tillstånd stamceller som visar pluripotens markörer egenskap hos ES-celler.
Protocol
Discussion
Dessa resultat visar att Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus set kan användas för att effektivt skapa iPS kolonierna genom att inducera den ektopisk uttryck för transduced transkriptionsfaktorer i mus embryonala fibroblaster. Vid utformningen av omprogrammering experiment bör flera variabler anses optimera effektiviteten i programplaneringen. Först är det möjligt att ändra den aktiva virus till målcellen ratio (dvs MOI) under primär infektion steg för att öka eller minska transduktion effektivitet, vilket påverkar antalet integrerade virus i målcellpopulationen. För det andra kan justera hur länge de celler utsätts för DOX påverka effektiviteten i iPS-celler koloni generation. Tredje kan proliferativ kapacitet målceller påverkan omprogrammering, som celler som aktivt växer och dividera är mer mottagliga för omprogrammering. Slutligen, när du ändrar protokollet för olika cell nummer eller olika storlek vävnad rätter kultur, rekommenderas att målcellen siffror justeras i proportion till ytan av kulturen skålen.
Disclosures
Författaren, Brad Hamilton, är anställd av Stemgent som producerar reagens och instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set | Stemgent | 00-0003 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., Yamanaka, S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321, 699-702 (2008).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Lerou, P. H., Daley, G. Q. Therapeutic potential of embryonic stem cells. Blood Rev. 19, 321-331 (2005).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
