Summary
De peritoneale holte in zoogdieren bevat verschillende immuun cel populaties cruciaal voor de aangeboren immuunrespons. Een efficiënte isolatie methode is vereist voor biochemische en functionele analyse van deze cellen. Hier bieden wij een uitgebreide methode voor de isolatie van de peritoneale holte cellen in de muis.
Abstract
De peritoneale holte is een membraan-gebonden en met vloeistof gevulde buikholte van zoogdieren, die de lever, de milt, het grootste deel van het maag-darmkanaal en andere ingewanden bevat. Het herbergt een aantal van de immuuncellen waaronder macrofagen, B-cellen en T-cellen. De aanwezigheid van een groot aantal naïeve macrofagen in de buikholte is het een te verkiezen plaats voor het verzamelen van naïeve weefsel inwoner macrofagen (1). De peritoneale holte is ook belangrijk voor de studie van B-cellen als gevolg van de aanwezigheid van een unieke buikholte-ingezeten B-cel subset bekend als B1 cellen in aanvulling op de conventionele B2 cellen. B1-cellen worden onderverdeeld in B1a en B1b cellen, die kunnen worden onderscheiden door de oppervlakte-expressie van CD11b en CD5. B1-cellen zijn een belangrijke bron van natuurlijke IgM vroegtijdig bescherming tegen een groot aantal pathogenen (2-4). Deze cellen zijn autoreactieve in de natuur (5), maar hoe ze worden gecontroleerd tot autoimmuniteit te voorkomen, is nog niet geheel duidelijk. Integendeel, CD5
Protocol
- Voordat u begint met het proces, de volgende items dienen te worden om verzameld en voorbereid:
- Ijs
- 5ml spuit met 27g naald
- 5ml spuit met 25g naald
- Styrofoam blok en pinnen voor het monteren van de muis
- Lade waarop de montage blok kan worden geplaatst
- Schaar en pincet
- Verzameling buizen
- 70% ethanol
- PBS met 3% foetaal kalf serum (FCS) (Pre gekoeld en bewaard op ijs)
- Euthanaseren van de muis, spray met 70% ethanol en monteer het op het piepschuim blok op zijn rug.
- Met behulp van een schaar en pincet snijd de buitenste schil van het buikvlies en voorzichtig terug te trekken naar de binnenste huid aan de binnenkant van de buikholte bloot te leggen.
- Injecteer 5 ml ijskoude PBS (met 3% FCS) in de buikholte met behulp van een 27g naald. Langzaam duw de naald in het buikvlies dat evenwel niet tot doorboren alle organen.
- Na injectie, zachtjes masseren het buikvlies naar alle aangesloten cellen in het PBS-oplossing te verwijderen.
- Plaats een 25 g naald, schuine rand op, gekoppeld aan een 5 ml spuit in het buikvlies en het verzamelen van de vloeistof tijdens het verplaatsen van de punt van de naald voorzichtig om te voorkomen dat verstopt raakt door het vetweefsel of andere organen. Verzamel zoveel mogelijk vocht en breng de verzamelde celsuspensie in buisjes op ijs bewaard na het verwijderen van de naald van de spuit.
Optioneel: Herhaal stap 4-6 - Maak een incisie in de binnenste huid van het buikvlies en terwijl de huid met een pincet te gebruiken een plastic Pasteur pipet om de resterende vloeistof te verzamelen uit de holte.
- Als in stap 6 of 7 zichtbaar besmet bloed wordt gedetecteerd dan het verontreinigde monster moet worden weggegooid.
- Spin van de verzamelde celsuspensie bij 1500 rpm gedurende 8 minuten, gooi het supernatant en resuspendeer de cellen in de gewenste media of PBS voor het tellen.
Alternatief protocol om thioglycollate verkrijgen opgewekt macrofagen:
Deze methode wordt gebruikt om een hogere opbrengst van macrofagen te verkrijgen.
- Injecteer 5 ml van 3% (w / v) Brewer thioglycollate medium (7) in de buikholte van elke muis.
- Wacht op 3-5 dagen, en ga verder met een vorige stap voor het verzamelen van de cellen.
Vergeleken met de nonelicited aanpak, kan ongeveer 10 keer meer macrofagen worden verzameld. De enige zorg is dat macrofagen verkregen door deze procedure verschillen in sommige van hun fysiologische eigenschappen.
Representatieve resultaten:
Uit een ongemanipuleerde muis, kan 5-10 miljoen buikholte cellen worden verkregen met een goede isolatie protocol. Van alle levende cellen, 50-60% zijn B-cellen, ~ 30% macrofagen en 5-10% zijn T-cellen (Fig 1).
Figuur 1. Fenotype van cellen geïsoleerd uit de buikholte. Na afsluiting van de buikholte cellen ze werden gekleurd met anti-muis TCRβ-FITC, B220-PE-Texas rood, CD11b-Stille Oceaan blauw, CD23-PE-Cy7 en CD5-APC. Vertegenwoordiger van flowcytometrische plots tonen percentages van B-en T-cellen (een), macrofagen (b), B1 en B2 cellen (c) en B1a en B1b cellen (d).
Discussion
Isolatie van peritoneale holte cellen is een belangrijke techniek voor de studie van verschillende immuuncellen, voornamelijk macrofagen en specifieke B-cel subsets. Hoewel dit een eenvoudig proces, zijn er een aantal betrokken kritische stappen. Aanwezigheid van contaminerende bloed in de verzamelde monster moet worden vermeden om een pure buikholte celpopulatie te verkrijgen. Euthanasie door cervicale dislocatie moet zorgvuldig worden gedaan om besmet bloed in de buikholte te vermijden. Als alternatief CO 2 kan worden gebruikt. Daarnaast moet tijdens de procedure goede zorg worden genomen om te voorkomen dat aanprikken van de blaas of enige andere organen in de buikholte. Herstellen de meeste van de geïnjecteerde vloeistof is ook belangrijk om de cel te geven.
Deze procedure wordt op grote schaal gebruikt om de macrofagen biologie, omdat matige aantallen inwoner studie, kunnen niet-gestimuleerde macrofagen gemakkelijk verkregen worden uit de buikholte, in tegenstelling tot de moeizame taak van het onderscheid myeloïde voorlopercellen cellen in volwassen macrofagen in vitro, met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (8 , 9). De macrofaag opbrengst van de buikholte kan worden verbeterd door gebruik te maken van de thioglycollate elicitatie methode, hoewel thioglycollate gebruik kunnen veranderen fysiologische eigenschappen van de macrofagen (7).
B-cellen zijn een belangrijk onderdeel van ons immuunsysteem speelt cruciale rol in zowel de aangeboren en adaptieve immuniteit. Tussen de verschillende B-cel subpopulaties, B1 cellen bestaan uit een unieke deelgroep van B-cellen die betrokken zijn bij aangeboren immuniteit, auto-immuniteit en immuunregulatie. B1 cellen zijn voornamelijk gelegen in de buikholte en zijn zelf aanvullen. Ze zijn een van de primaire producenten van natuurlijke IgM waarvan de eerste regel van de bescherming tegen een aantal virussen en bacteriën (10-12) biedt. B1-cellen zijn ook een belangrijke bron van IL-10 (6), dat is een belangrijk cytokine die betrokken zijn bij immuun regelgeving. Hoewel verschillende studies zijn gevoerd met de B1 cellen, er nog steeds ruimte is voor verdere evaluatie van hun contrasterende functies, in het bijzonder hun regulerende rol. Buikholte celisolatie methode biedt de unieke mogelijkheid om de functies van de B1 cellen te bestuderen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door de NIH subsidie AI069358 en de BloodCenter Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
