Summary
La cavité péritonéale chez les mammifères contient différentes populations de cellules immunitaires crucial pour les réponses immunitaires innées. Une méthode d'isolation efficace est nécessaire pour les analyses biochimiques et fonctionnelles de ces cellules. Ici nous fournissons une méthode globale pour l'isolement des cellules cavité péritonéale chez la souris.
Abstract
La cavité péritonéale est une cavité membranaires et remplis de fluide abdominal de mammifères, qui contient le foie, la rate, la plupart du tractus gastro-intestinal et d'autres viscères. Il abrite un certain nombre de cellules immunitaires, y compris les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T. La présence d'un nombre élevé de macrophages naïfs dans la cavité péritonéale en fait un site privilégié pour la collecte des naïfs macrophages résidents du tissu (1). La cavité péritonéale est également important pour l'étude des cellules B en raison de la présence d'une cavité péritonéale unique de sous-résident de cellules B ou cellules B1, en plus de cellules B2 conventionnels. Cellules B1 sont subdivisées en cellules B1a et B1b, qui peut être distingué par l'expression de surface de CD11b et CD5. Cellules B1 sont une source importante d'IgM naturels offrant une protection précoce d'une variété de pathogènes (2-4). Ces cellules sont autoréactifs dans la nature (5), mais comment ils sont contrôlés pour éviter l'auto-immunité n'est pas encore parfaitement compris. Au contraire, CD5
Protocol
- Avant de commencer le processus, les éléments suivants doivent être recueillis et préparés à:
- Glace
- Seringue de 5 ml avec aiguille 27G
- Seringue de 5 ml avec aiguille 25g
- Styrofoam blocs et des épingles pour le montage de la souris
- Plateau sur lequel le bloc de montage peut être placé
- Ciseaux et pinces
- Tubes de prélèvement
- 70% d'éthanol
- PBS avec 3% sérum de veau foetal (FCS) (pré refroidis et conservés sur glace)
- Euthanasier la souris, le vaporiser avec de l'éthanol 70% et le monter sur le bloc de styromousse sur le dos.
- En utilisant une paire de ciseaux et des pinces à couper la peau externe du péritoine et tirez en arrière pour exposer la peau intérieure tapissant la cavité péritonéale.
- Injecter 5 ml de PBS glacé (avec 3% de FCS) dans la cavité péritonéale à l'aide d'une aiguille 27G. Poussez l'aiguille lentement dans le péritoine en faisant attention à ne pas percer tous les organes.
- Après l'injection, masser doucement le péritoine pour déloger les cellules attachées dans la solution PBS.
- Insérer une aiguille de 25 g, biseau vers le haut, attachée à une seringue de 5 ml dans le péritoine et recueillir le liquide tout en déplaçant la pointe de l'aiguille doucement pour éviter le colmatage par le tissu adipeux ou d'autres organes. Recueillir autant de liquide que possible et le dépôt de la suspension cellulaire recueilli dans des tubes conservés sur la glace après avoir retiré l'aiguille de la seringue.
En option: 4-6 Répétez l'étape - Faire une incision dans la peau intérieure du péritoine et tout en maintenant la peau avec une pince utiliser une pipette Pasteur en plastique pour recueillir le liquide restant dans la cavité.
- Si à l'étape 6 ou 7 contamination du sang visible est détectée, alors l'échantillon contaminé doit être jeté.
- Faites tourner la suspension de cellules recueillies à 1500 RPM pendant 8 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans les médias souhaités ou PBS pour le comptage.
Protocole alternatif pour obtenir thioglycolate suscité des macrophages:
Cette méthode est utilisée pour obtenir un rendement plus élevé des macrophages.
- Injecter 5 ml de 3% (p / v) Brewer milieu au thioglycolate (7) dans la cavité péritonéale de chaque souris.
- Attendre pendant 3-5 jours, et passez à l'étape 1 ci-dessus pour la collecte des cellules.
Comparativement à l'approche nonelicited, environ 10 fois plus de macrophages peuvent être collectées. Le seul souci est que les macrophages obtenus par cette procédure diffèrent dans certaines de leurs propriétés physiologiques.
Les résultats représentatifs:
De une souris non manipulée, 5-10 millions de cellules cavité péritonéale peut être obtenue avec un protocole de bonne isolation. Parmi toutes les cellules vivantes, 50-60% sont des cellules B, macrophages ~ 30% et 5-10% sont des cellules T (figure 1).
Figure 1. Phénotype des cellules isolées de la cavité péritonéale. Isolement de cellules Après la cavité péritonéale, ils ont été colorés avec anti-souris-FITC TCRβ, B220-PE-rouge Texas, CD11b-Pacifique bleu, CD23-PE-Cy7 et CD5-APC. Parcelles de flux représentant cytométrie montrent des pourcentages de cellules B et T (a), les macrophages (b), B1 et B2 cellules (c) et les cellules B1a et B1b (d).
Discussion
Isolement de cellules cavité péritonéale est une technique importante pour l'étude des différentes cellules du système immunitaire, principalement les macrophages et les sous-ensembles spécifiques de cellules B. Bien que ce processus est simple, il ya quelques étapes essentielles impliquées. Présence de contamination du sang dans l'échantillon prélevé doit être évitée afin d'obtenir un pur population cellulaire péritonéale cavité. L'euthanasie par dislocation cervicale doit être effectuée avec soin pour éviter toute contamination du sang dans la cavité péritonéale. Alternativement CO 2 peuvent être utilisés. En outre, pendant les soins procédure appropriée devrait être prise pour éviter la perforation de la vessie ou d'autres organes dans la cavité péritonéale. Récupérer la plupart du liquide injecté est également important pour le rendement cellulaire.
Cette procédure est largement utilisée pour étudier la biologie des macrophages, depuis un nombre modéré de résident, les macrophages non stimulés peuvent facilement être obtenus à partir de la cavité péritonéale, contrairement à la tâche laborieuse de différenciation des cellules progénitrices myéloïdes en macrophages matures in vitro, en utilisant le facteur de croissance macrophages (8 , 9). Le rendement des macrophages de la cavité péritonéale peut être améliorée en utilisant la méthode de l'élicitation thioglycolate, bien que l'utilisation thioglycolate pourraient altérer les propriétés physiologiques des macrophages (7).
Les cellules B sont une partie importante de notre système immunitaire joue un rôle crucial dans les deux immunité innée et adaptative. Parmi les différentes sous-populations de cellules B, les cellules B1 comprend un sous-ensemble unique de cellules B impliquées dans l'immunité innée, l'auto-immunité et de la régulation immunitaire. Cellules B1 sont principalement situés dans la cavité péritonéale et sont la reconstitution de soi. Ils sont l'un des principaux producteurs d'IgM naturel qui assure la première ligne de protection contre un certain nombre de virus et de bactéries (10-12). Cellules B1 sont aussi une source importante d'IL-10 (6), qui est une cytokine importante impliquée dans la régulation immunitaire. Bien que plusieurs études ont été menées avec les cellules B1, encore il ya place pour une évaluation plus poussée de leurs fonctions contrastées, spécialement leur rôle de régulation. Péritonéale méthode d'isolement cavité cellulaire offre l'opportunité unique d'étudier les fonctions des cellules B1.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par NIH AI069358 et la Fondation de recherche BloodCenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD Biosciences | 211716 |
References
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