이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시<em> Drosophila</em빠른 자석 구슬 도움 셀 정렬 전략을 사용하기> 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.
Abstract
<em> Drosophila</em> 주변 신경계 (PNS)는 기능과 분자 수준에서의 연결을 개발 및 dendrite의 morphogenesis의 복잡한 프로세스를 조사위한 강력한 모델입니다. 이러한 분석에 도움이하기 위해, 우리는 PNS의 신경의 하위 클래스의 고립을위한 전략 돌기 arborization (DA) 널리 dendrite morphogenesis을 공부에 사용되었습니다 뉴런이라는 개발<sup> 1,2</sup>. 이들 뉴런은 힘든 chitinous 애벌레 표피 아래에 위치를 도달하기 어려운 매우 순수 인구로 분리하기 어려운 그들의 매우 낮은 발생하는 부분 때문에 그들입니다. 우리의 새로 개발된 방법은 이러한 문제를 극복하고, 항체 – 코팅 자기 구슬을 사용하여 신속하고 특정 세포 강화에 따라 달라집니다. 우리 자기 비드 정렬 연구, 우리는 마우스 CD8 태그 GFP 융합 단백질을 (표현 나이에 일치하는 세번째 instar의 애벌레를 사용한<em> UAS – mCD8 – GFP</em>)<sup> 3</sup> 클래스 IV의 돌기의 arborization 하나의 제어하에 (DA) 신경 세포 특정<em> 소매치기 (PPK) GAL4</em> 드라이버<sup> 4</sup> 또는 팬 – DA 뉴런 특정 GAL4의 통제<sup> 21-7</sup> 드라이버<sup> 5</sup>. 이 프로토콜은 몇 가지 매개 변수를 변화하여 애벌레 표피의 내부 벽에 연결된 PNS 세포를 분리에 최적화된되어 있지만, 같은 프로토콜의 애벌레 또는 pupal 단계에서 표피에 부착된 여러 세포 유형을 분리하는 데 사용될 수 개발 (예 : 상피 조직, 근육, oenocytes 등), 또는 GAL4 특정 드라이버 표현 패턴에 따라 애벌레 기관에서 다른 세포 유형. 이 방법에 의해 분리된 RNA는 높은 품질이며 쉽게 이러한 microarray 유전자 발현 프로 파일링 연구로 하류 게놈 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 격리에 대한 연구를 수행하는 강력한 새로운 도구를 제공합니다<em> Drosophila</em따라서 dendrite morphogenesis를 기본 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공> 돌기 arborization (DA) 뉴런.
Protocol
Drosophila 주변의 뉴런의 마그네틱 비드 정렬에 대한 일반 댓글 (의정서의 완료에 대한 총 타이밍 : 2.5-3 시간) 깨끗하고 RNAse 무료로 환경을 유지하기위한 표준 실험실 절차 RNA 저하를 방지하기 위해 항상 준수해야합니다. Drosophila 애벌레의 표피가 해부 및 세포 분리 버퍼에 배치되면, 주변 신경은 표피에서 분리 마지막 셀 중 하나입니다. 우?…
Discussion
여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 ?…
Acknowledgements
우리는 DRS 감사합니다. Yuh – Nung 본 연구에 사용된 비행 주식을 제공하고 월 웨스 Grueber. 저자 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념이 연구의 지원 트러스트 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보츠 사무소 (EPRI)을 인정합니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)
MP Bioproducts
PBS10X02
Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3
Roche
11814176001
Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY
Sigma-Aldrich
83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody
Invitrogen
MCD0815
100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V
GibcoBRL
11018-017
Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin
Invitrogen
11205D
1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit
Molecular Devices
KIT0204
Follow manufacturer’s instructions
Equipment
(10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
Vortex
Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting. J. Vis. Exp. (34), e1599, doi:10.3791/1599 (2009).