عزل وتنقية ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية الطرفية بواسطة حبة فرز المغناطيسي
Summary
في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم طريقة لعزل وتنقية<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية الطرفية باستخدام حبة المغناطيسي فرز سريع بمساعدة الخلية الاستراتيجية. ويمكن الحصول عليها من الحمض النووي الريبي خلايا منعزلة استخدامها بسهولة لتطبيقات المصب بما في ذلك تحليلات ميكروأري.
Abstract
و<em> ذبابة الفاكهة</em> الجهاز العصبي المحيطي (PNS) هو نموذج قوي للتحقيق في العمليات المعقدة للتنمية الخلايا العصبية والتشكل تغصن على الصعيدين الوظيفي والجزيئي. للمساعدة في هذه التحليلات ، وضعنا استراتيجية لعزل فئة فرعية من الخلايا العصبية تسمى PNS تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة التشكل تغصن<sup> 1،2</sup>. هذه الخلايا العصبية من الصعب جدا عزل السكان باعتبارها محض ، ويرجع ذلك في جزء منه إلى وقوعها منخفضة للغاية ولها ، يصعب الوصول إليها الموقع تحت إهاب صعبة كيتيني اليرقات. أسلوبنا وضعت حديثا يتغلب على هذه التحديات ، ويستند إلى تخصيب الخلية سريع ومحدد باستخدام الأجسام المضادة المغلفة الخرز المغناطيسي. لدينا دراسات الفرز المغناطيسي حبة ، وقد استخدمنا سن المطابقة اليرقات طور مرحلي third معربا عن ماوس CD8 الموسومة البروتين GFP الانصهار (<em> UAS – mCD8 – GFP</em>)<sup> 3</sup> تحت سيطرة إما شجيري تشجر الطبقة الرابعة (دا) الخلايا العصبية الخاصة<em> النشل (PPK) – GAL4</em> سائق<sup> 4</sup> أو السيطرة على الخلايا العصبية الخاصة GAL4 عموم دا<sup> 21-7</sup> سائق<sup> 5</sup>. على الرغم من أنه تم تحسين هذا البروتوكول من أجل عزل خلايا الجهاز العصبي المحيطي التي تعلق على الجدار الداخلي للبشرة اليرقات ، من خلال تغيير عدد قليل من المعالم ، يمكن أن تستخدم نفس البروتوكول لعزل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعلق على بشرة في مراحل اليرقات أو من العذراء التنمية (على سبيل المثال ظهائر والعضلات وoenocytes الخ) ، أو أنواع أخرى من أجهزة الخليوي اليرقات تبعا لنمط التشغيل التعبير GAL4 محددة. الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام هذا الأسلوب هو من نوعية عالية ، ويمكن استخدامها بسهولة لتحليلات الجينومية المصب مثل الدراسات ميكروأري الجينات التنميط التعبير. هذا النهج يوفر أداة قوية جديدة لإجراء دراسات حول معزولة<em> ذبابة الفاكهة</em> شجيري تشجر (دا) الخلايا العصبية وبالتالي توفير رؤى جديدة في الآليات الجزيئية الكامنة وراء تغصن التشكل.
Protocol
Discussion
هو الأمثل للبروتوكول المعروضة هنا لعزل وتنقية الخلايا العصبية المحيطية التي تتقيد باحكام على السطح الداخلي للبشرة third ذبابة الفاكهة اليرقات طور مرحلي باستخدام الفرز المغناطيسي خلية حبة الاستراتيجية. في حين أننا قد استخدمت هذا البروتوكول على وجه التحديد لعزل الخلا?…
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. Yuh – ننغ جان وGrueber ويس لتوفير مخزونات الطيران المستخدمة في هذه الدراسة. الكتاب يعترف F. توماس ميلر وكيت Jeffress التذكارية الاستئماني لدعم هذه البحوث (DNC) ومكتب جامعة جورج ماسون في بروفوست (EPRI).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
