Summary
Lensfree on-chip-avbildning och karakterisering av celler illustreras. Detta på-chip cell imaging metod ger ett kompakt och kostnadseffektivt verktyg för medicinsk diagnostik och hög genomströmning cell tillämpningar biologi, vilket gör den speciellt lämplig för resurssvaga inställningar.
Abstract
Konventionella optiska mikroskop bild celler med hjälp av objektiva linser som fungerar tillsammans med andra linser och optiska komponenter. Medan ganska effektiva, har detta klassiska synsätt vissa begränsningar för miniatyrisering av att avbilda plattform för att göra den kompatibel med den avancerade toppmoderna i mikrofluidik. I denna rapport presenterar vi experimentella uppgifter om en lensless on-chip bildbehandling konceptet kallas LUCAS (
Protocol
Här diskuterar vi de experimentella metoder som är involverade i LUCAS [1-3]. För att illustrera proof of concept av LUCAS kommer vi att beskriva imaging process för ett helblodsprov.
A. Imaging Set-up
LUCAS Imaging plattformen uppvisar betydande fördelar att erbjuda en kostnadseffektiv och kompakt alternativ till befintliga point-of-care Cytometry och medicinska diagnostiska verktyg, särskilt för begränsade resurser inställningar. Hellre än att upptäcka bilden av celler, fångar Lucas istället digitala hologram av cellerna som skapas genom inblandning av det spridda ljuset från varje cell med bakgrundsbelysning. Noggrann kontroll av den partiella rumsliga sammanhang av den belysning är avgörande för att holografisk inspelning.
1. Digital Sensor Array
LUCAS-plattformen utnyttjar en optoelektronisk sensorer att digitalt registrera enskild cell hologram. För detta ändamål laddade par enheter (CCD, Sample modeller: Kai-11.002, KAF-39 tusen, från Kodak) eller kompletterande metall-oxid-halvledarkretsar (CMOS, Sample Modell: MT9P031, Micron) kan användas. Pixel storlekar för Kodak laddade par enheter, Kai-11.002, KAF-39 tusen, och Micron CMOS-bildsensorer är 9 ìm, 6,8 ìm och 2,2 mikrometer och en aktiv FOV på 10 cm2, 18 cm2 och 24,4 mm2, respektive. [1-2].
2. Ljuskälla
Till skillnad från de flesta andra mikroskopiska avbildningsmetoder, kräver LUCAS inte en laser och därmed även en enkel lysdiod (LED) kan användas för belysning. För att avstämbara våglängd belysning, kan vi använda även en monokromator med en xenonlampa (Cornerstone T260, Newport Corp) tillsammans med en standardform kvarts fiber som består av en bunt av fibrer (77.564, Newport) och hål på ~ 100 ìm diameter ligger på ~ 5-10 cm ovanför sensorn. Detta avstämbara våglängd belysning konfiguration ger en flexibel plattform där holografiska underskrifter av cellerna kan justeras, och hybrid digitala signaturer kan syntetiseras för att förbättra signal-brus-förhållandet för bättre karakterisering noggrannhet och specificitet. [3]
B. Provberedning och Imaging
Ett bevis på begreppet LUCAS baseras på chip imaging kommer att demonstreras med hjälp av en heterogen lösning som beskrivs nedan. Ett liknande protokoll skulle kunna tillämpas för flera andra celltyper [1-3].
1. Helblod utspädning och beredning av heterogena lösningen
- Till att börja processen att få ett helblodsprov och mikrokulor polystyren av olika diameter (5, 10 och 20 mikrometer. Duke vetenskapliga), och föra dem alla till rumstemperatur.
- Tillsätt 2 ml RPMI 1640 klassiska flytande medier (Fisher Scientific) som spädningsmedel i en steril 5 ml polypropylen rör.
- Efter inkubering av helblodsprovet i 30 minuter, pipett upp 10 mikroliter av sedimenterade erytrocyter prov och överför den till RPMI lösningen.
- Lägg till en total volym av 20 mikroliter polystyren mikrokulor i erytrocyt RPMI utspädning och skaka cellen lösningen genom att försiktigt pipettera eller med magnetomrörare med en omrörare.
- Placera en total volym av 5-15 mikroliter heterogena lösningen på ett täckglas och placera en andra, identiska täcka glida över lösningen med hjälp av pincett. Provet bör vara inklämt mellan två täckglas jämnt.
- Då, med en dammsugare penna (NT57-636, Edmund Optics) belastning provet på det aktiva regionen av sensorer för avbildning.
2. Helblod färgning
- Från och med beredningen av en blandning av 0,1% buffrat Eosin Y och efter utspädning Nya Methylene lösning med hjälp av ström typ ren Eosin Y (MW = 691,85, Acros Organics), zink-fri ren New Methylene blått färgämne (MW = 347,90, Acros Organics) och Kalium monohydrat (99,0% Reagens ACS, Acros Organics), varje lösning renas med 0,45 ìm porstorlek Syringless Filter (Whatman) för vattenhaltiga vita blodkroppar färgning.
- Sedan försiktigt rör om ett löst vattenlösning färgning reagens med hela blodprov på en volym på 1:1 i ett polypropylen bägare med hjälp av en magnetomrörare i 2 minuter och inkubera i 10 minuter.
- Överför ett målat blod lösning av 50 mikroliter till ett 5 ml polypropylen rör och späd med RPMI 1640 klassiska flytande lösning (Fisher Scientific) på 1,95 ml att skaffa en volym förhållandet 1:200. Sedan virvel utspädningen i 30 sekunder. En annorlunda utspädningsförhållandet kan även införas i detta skede.
- Pipettera en färgad cell lösning av 10-100 mikroliter mellan täckglas eller inom en mikroflödessystem reservoar. Då, med en dammsugare penna (NT57-636, Edmund Optics), placera provet på det aktiva regionen av sensorer.
Representativa resultat
ve_content ">
Figur 1: LUCAS möjliggör korrekt räkna och digitala differentiering av olika celler och mikro-objekt baserat på deras 2D holografiska signaturer utan att använda några linser, laser eller andra skrymmande optiska komponenter. Kännetecknande LUCAS underskrifter av olika mikro-objekt illustreras i denna siffra och jämförs mot ett konventionellt mikroskop bild fås med en 40X objektiv. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Figur 2: (vänster) Raw bild av en heterogen blandning som innehåller röda blodkroppar, 10um, 5um och 3 um partiklar. (Höger) helautomatiska LUCAS karakterisering resultat för samma synfält belyses. Observera att beslutet algoritmen är robust i kännetecknar hög densitet regioner samt partiklar med låg signal-brus-förhållande som 3um pärlor.
Figur 3: LUCAS anpassat gränssnitt illustreras. Java-baserade LUCAS programvara kan ingångar för olika experimentella förhållanden som sensorn pixelstorlek eller ljusets våglängd. Val av en speciell synfält på bilden kan även göras och målcellen mönster kan definieras av användaren för att bygga en statistisk bibliotek cell skugga. Den förvärvade LUCAS Bilden kan sedan präglas grundar sig på detta träningsdata (dvs cellen skuggan biblioteket) och märkt (räknade) bild visas för användaren. Statistik över räkningen resultaten är också lagras som en XML-fil för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har visat att LUCAS plattformen exakt kan räkna och identifiera olika micro-objects/cells på ett chip baserat på deras holografiska signaturer, och ger ett lovande verktyg för point-of-care medicinsk diagnostik och hög genomströmning cell-biologi. För korrekt att bearbeta det inspelade holografiska mönster, genomförde vi en egen utvecklad LUCAS beslut programvara. Denna algoritm, som använder en statistisk databas diffraktion bilden skapas genom utbildning av LUCAS bilder, identifierar olika funktioner i celler i en heterogen lösning, klassificerar typen och den relativa positionen för enskilda celler och räknar önskad celltyp efter applicering tröskling ta bort oönskad partikel / cell mönster [1-3].
Sammanfattningsvis bör LUCAS-plattformen ger en kostnadseffektiv och kompakt lösning för point-of-care Cytometry och medicinsk diagnostik. För detta ändamål kommer LUCAS vara särskilt användbart för övervakning av hiv-patienter i resursfattiga begränsad inställningar samt för andra globala hälsorelaterade problem som malaria och tuberkulos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
