Summary
Lensfree पर चिप और कोशिकाओं के लक्षण वर्णन इमेजिंग सचित्र है. यह सेल पर चिप इमेजिंग दृष्टिकोण चिकित्सा निदान और उच्च throughput कोशिका जीव विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए एक कॉम्पैक्ट और लागत प्रभावी उपकरण प्रदान करता है, यह विशेष रूप से संसाधन गरीब सेटिंग्स के लिए उपयुक्त बना.
Abstract
परम्परागत उद्देश्य लेंस है कि अन्य लेंस और ऑप्टिकल घटकों के साथ मिलकर काम का उपयोग द्वारा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि कोशिकाओं. जबकि काफी प्रभावी है, इस शास्त्रीय दृष्टिकोण इमेजिंग के लिए microfluidics में कला के उन्नत राज्य के साथ संगत बनाने के मंच के miniaturization के लिए कुछ सीमाएँ हैं. इस रिपोर्ट में, हम एक lensless इमेजिंग चिप पर लुकास करार दिया अवधारणा के प्रयोगात्मक विवरण (परिचय
Protocol
यहाँ हम प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि लुकास [1-3] में शामिल हैं पर चर्चा की. लुकास की अवधारणा के सबूत वर्णन करने के लिए हम एक पूरे रक्त के नमूने के लिए इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन करेंगे.
ए सेट अप इमेजिंग
लुकास इमेजिंग मंच महत्वपूर्ण लाभ दर्शाती मौजूदा cytometry बिंदु की देखभाल और नैदानिक चिकित्सा उपकरणों के लिए विशेष रूप से सीमित संसाधनों वाली स्थितियों के लिए एक लागत प्रभावी और कॉम्पैक्ट विकल्प प्रदान. बल्कि कोशिकाओं की छवि का पता लगाने के से, लुकास बजाय कोशिकाओं है कि पृष्ठभूमि प्रकाश के साथ प्रत्येक कक्ष से बिखरे हुए प्रकाश के हस्तक्षेप द्वारा बनाई गई हैं डिजिटल होलोग्राम कब्जा. रोशनी की आंशिक स्थानिक जुटना की सावधानी से नियंत्रण holographic रिकॉर्डिंग को सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है.
1. डिजिटल संवेदक सरणी
लुकास एक optoelectronic सेंसर करने के लिए डिजिटल व्यक्तिगत सेल होलोग्राम रिकॉर्ड सरणी मंच का इस्तेमाल करता. इस प्रयोजन के लिए, जोड़ा (सीसीडी, नमूना मॉडल: काई 11,002, कोडक से KAF 39,000,) उपकरणों का आरोप लगाया या पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक चिप्स (CMOS, नमूना मॉडल: MT9P031, माइक्रोन) इस्तेमाल किया जा सकता. कोडक के लिए पिक्सेल आकार कुछ उपकरणों, काई 11,002, KAF-३९००० का आरोप लगाया, और माइक्रोन CMOS छवि सेंसर 9 सुक्ष्ममापी है, 6.8 सुक्ष्ममापी और 2.2 सुक्ष्ममापी हैं, एक सक्रिय 10 cm2 के FOV, 18 cm2, और mm2 24.4 के साथ, क्रमशः. [1-2].
2. प्रकाश स्रोत
सबसे अन्य सूक्ष्म इमेजिंग रूपात्मकता के विपरीत, लुकास एक लेजर और इसलिए भी एक साधारण प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रोशनी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की आवश्यकता नहीं है. Tunable तरंगदैर्ध्य रोशनी सक्षम करने के लिए आदेश में, हम भी एक मानक ग्रेड जुड़े सिलिका फाइबर जो फाइबर का एक बंडल (77,564, न्यूपोर्ट) और के pinhole होते के साथ एक क्सीनन दीपक (T260 आधारशिला, न्यूपोर्ट कार्पोरेशन) के साथ एक monochromator का उपयोग कर सकते हैं ~~ 100 सुक्ष्ममापी व्यास ~ 5-10 सेमी सेंसर सतह से ऊपर पर स्थित है. इस tunable तरंगदैर्ध्य रोशनी विन्यास एक लचीला मंच है जहां कोशिकाओं के holographic हस्ताक्षर समायोजित किया जा सकता है प्रदान करता है, और संकर डिजिटल हस्ताक्षरों के बेहतर लक्षण वर्णन सटीकता और विशिष्टता के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार संश्लेषित किया जा सकता है. [3]
बी नमूना तैयार करना और इमेजिंग
लुकास की अवधारणा का एक सबूत है इमेजिंग चिप पर आधारित एक विषम समाधान का उपयोग कर के रूप में नीचे वर्णित प्रदर्शन किया जाएगा. एक समान प्रोटोकॉल विभिन्न अन्य सेल [1-3] प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.
1. पूरे रक्त कमजोर पड़ने और विषम समाधान की तैयारी
- प्रक्रिया शुरू करने के लिए, एक पूरे रक्त के नमूने और विभिन्न व्यास (5, 10, और 20 सुक्ष्ममापी ड्यूक वैज्ञानिक) polystyrene microbeads प्राप्त है, और कमरे के तापमान के लिए उन सभी को लाने.
- एक बाँझ 5 एमएल polypropylene ट्यूब में एक मंदक के रूप RPMI 1640 क्लासिक तरल मीडिया (फिशर साइंटिफिक) के 2 एमएल जोड़ें.
- 30 मिनट के लिए पूरे रक्त के नमूने incubating के बाद, sedimented एरिथ्रोसाइट नमूना के 10 μL विंदुक और यह RPMI समाधान में स्थानांतरण.
- एरिथ्रोसाइट RPMI कमजोर पड़ने में 20 μL polystyrene microbeads की कुल मात्रा को जोड़ें, और धीरे pipetting या हलचल पट्टी के साथ चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करके कक्ष समाधान आंदोलन.
- एक कवर पर 5-15 μL विषम समाधान की कुल मात्रा प्लेस पर्ची और एक दूसरे, संदंश का उपयोग करके समाधान से अधिक समान कवर पर्ची जगह. नमूना दो कवर समान रूप से निकल जाता है के बीच sandwiched होना चाहिए.
- फिर, एक वैक्यूम कलम (NT57-636, एडमंड प्रकाशिकी) का उपयोग इमेजिंग के लिए संवेदक सरणी के सक्रिय क्षेत्र पर नमूना लोड.
2. पूरे रक्त धुंधला
- 0.1% की एक मिश्रण की तैयारी के साथ शुरू शक्ति प्रकार शुद्ध Eosin वाई (मेगावाट = 691.85, acros ऑर्गेनिक्स), जस्ता मुक्त शुद्ध नई Methylene ब्लू डाई (मेगावाट = 347.90, acros ऑर्गेनिक्स) का उपयोग करके Eosin Y और पतला नई Methylene समाधान buffered, और पोटेशियम Oxalate Monohydrate (99.0% अभिकर्मक ACS, acros ऑर्गेनिक्स), प्रत्येक समाधान 0.45 सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार Syringless (वाटमान) फ़िल्टर जलीय सफेद रक्त कोशिका धुंधला के लिए के साथ शुद्ध है.
- फिर, धीरे पूरे रक्त नमूने के साथ एक polypropylene बीकर में 01:01 का एक मात्रा के अनुपात में 2 मिनट के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग करके एक भंग जलीय धुंधला अभिकर्मक हलचल और 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक 5 एमएल polypropylene ट्यूब में 50 μL का एक दाग रक्त समाधान स्थानांतरण और RPMI +१,६४० 1.95 एमएल क्लासिक तरल समाधान (फिशर साइंटिफिक) के साथ पतला की एक मात्रा अनुपात 1:200 हासिल है. फिर, भंवर 30 सेकंड के लिए कमजोर पड़ने. एक अलग कमजोर पड़ने की दर भी इस स्तर पर शुरू किया जा सकता है.
- कवर फिसल जाता है के बीच या एक microfluidic जलाशय के भीतर 10-100 μL के दाग सेल समाधान पिपेट. फिर, एक वैक्यूम कलम (NT57-636, एडमंड प्रकाशिकी) का उपयोग संवेदक सरणी के सक्रिय क्षेत्र पर नमूना जगह.
प्रतिनिधि परिणामों
"ve_content>
चित्रा 1: लुकास सटीक गिनती और किसी भी लेंस, लेज़रों या अन्य भारी ऑप्टिकल घटकों का उपयोग कर के बिना अपने 2 डी holographic हस्ताक्षर के आधार पर विभिन्न कोशिकाओं और सूक्ष्म वस्तुओं के डिजिटल भेदभाव सक्षम बनाता है. विभिन्न सूक्ष्म वस्तुओं की विशेषता लुकास हस्ताक्षर यह आंकड़ा में सचित्र हैं और एक पारंपरिक खुर्दबीन एक 40x उद्देश्य लेंस के साथ प्राप्त की छवि के खिलाफ तुलना कर रहे हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.
चित्रा 2: (बाएं) एक विषम मिश्रण युक्त लाल रक्त कोशिकाओं, 10um, 5um और 3 उम कणों के कच्चे छवि. (अधिकार) को देखने के एक ही क्षेत्र के लिए पूरी तरह से स्वचालित लुकास लक्षण वर्णन परिणाम सचित्र हैं. ध्यान दें कि निर्णय एल्गोरिथ्म 3um मोती जैसे शोर अनुपात करने के लिए उच्च घनत्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कम संकेत के साथ कणों निस्र्पक क्षेत्रों में मजबूत है.
चित्रा 3: लुकास कस्टम अंतरफलक सचित्र है. जावा आधारित लुकास सॉफ्टवेयर संवेदक पिक्सेल आकार या प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के लिए आदानों की अनुमति देता है. छवि पर देखने के एक विशिष्ट क्षेत्र का चयन भी किया जा सकता है एक सांख्यिकीय सेल छाया पुस्तकालय का निर्माण लक्ष्य कक्ष पैटर्न उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया जा सकता. अधिग्रहीत लुकास छवि तो इस प्रशिक्षण डेटा (यानी, सेल छाया लायब्रेरी) और चिह्नित छवि (गिना) उपयोगकर्ता के लिए प्रदर्शित किया जाता है पर आधारित विशेषता जा सकता है. गणना परिणाम के सांख्यिकी भी आगे के विश्लेषण के लिए एक XML फ़ाइल के रूप में संग्रहीत हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम सचित्र है कि लुकास मंच सही गिनती और उनके holographic हस्ताक्षर के आधार पर एक चिप पर विभिन्न micro-objects/cells की पहचान कर सकते हैं, और बिंदु का ध्यान चिकित्सा निदान और उच्च throughput सेल जीव विज्ञान के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करता है. आदेश में सही दर्ज holographic पैटर्न की प्रक्रिया करने के लिए, हम एक कस्टम विकसित लुकास निर्णय सॉफ्टवेयर को कार्यान्वित किया. इस एल्गोरिथ्म, जो एक सांख्यिकीय विवर्तन छवि लुकास छवियों के प्रशिक्षण के द्वारा बनाई गई डेटाबेस का उपयोग करता है एक विषम समाधान के भीतर कोशिकाओं के विभिन्न सुविधाओं को दिखाता है, व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रकार और सापेक्ष स्थिति के वर्गीकरण और thresholding लागू करने के लिए अवांछित कण त्यागने के बाद वांछित कोशिका प्रकार मायने रखता है / सेल पैटर्न [1-3].
संक्षेप में, लुकास मंच बिंदु की देखभाल cytometry और चिकित्सा निदान के लिए एक लागत प्रभावी और कॉम्पैक्ट समाधान प्रदान करना चाहिए. यह अंत करने के लिए, लुकास विशेष रूप से एचआईवी रोगियों की निगरानी के लिए संसाधन सीमित सेटिंग में के रूप में अच्छी तरह के रूप में मलेरिया और तपेदिक जैसे अन्य वैश्विक स्वास्थ्य संबंधी समस्याओं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
