Summary
ويتضح Lensfree على رقاقة التصوير وتوصيف الخلايا. هذا التصوير الخلية على الرقاقة النهج يوفر أداة مدمجة وفعالة من حيث التكلفة للتشخيص الطبي وتطبيقات الإنتاجية العالية بيولوجيا الخلايا ، مما يجعلها مناسبة خاصة بالنسبة للإعدادات الموارد الفقيرة.
Abstract
صورة المجاهر البصرية التقليدية عن طريق استخدام خلايا الهدف العدسات التي تعمل مع العدسات البصرية والمكونات الأخرى. في حين فعالة للغاية ، وهذا النهج الكلاسيكي له حدود معينة لالتصغير من منصة التصوير لجعلها متوافقة مع حالة متقدمة من الفن في على microfluidics. في هذا التقرير ، ونحن نقدم تفاصيل تجريبية لمفهوم التصوير lensless على رقاقة ووصف لوكاس (
Protocol
هنا نناقش الإجراءات التجريبية التي تشارك في لوكاس [1-3]. لتوضيح دليل على مفهوم لوكاس سنقوم بشرح عملية التصوير لعينة من الدم الكامل.
ألف التصوير تعيين المتابعة
يسلك منصة التصوير لوكاس مزايا هامة لتوفير بديل فعالة من حيث التكلفة ومدمجا إلى الخلوي نقطة من الرعاية القائمة ، وأدوات التشخيص الطبي ، لا سيما عن المناطق ذات الموارد المحدودة. بدلا من الكشف عن صورة من الخلايا ، لوكاس يلتقط الصور المجسمة الرقمية بدلا من الخلايا التي يتم إنشاؤها بواسطة التدخل من الضوء المتناثرة من كل خلية في ضوء الخلفية. مراقبة دقيقة لضمان اتساق والمكانية الجزئي للإنارة أمر حاسم لتمكين تسجيل الثلاثية الأبعاد.
1. الاستشعار الرقمية صفيف
منصة تستخدم لوكاس صفيف الاستشعار البصرية الالكترونية لتسجيل الصور المجسمة رقميا الخلية الفردية. لهذا الغرض ، وجهت الأجهزة زوجين (CCD ؛ نماذج العينة : كاي 11002 ، 39000 ، KAF من كوداك) أو تكميلية المعادن أكسيد اشباه الموصلات رقائق (CMOS ، الموديل العينة : MT9P031 ، ميكرون) يمكن استخدامها. اتهم أحجام بكسل لكوداك أجهزة زوجين ، كاي 11002 ، 39000 ، KAF ، وأجهزة الاستشعار المكمل صورة الميكرون هي 9 ميكرون ، ميكرومتر 6.8 و 2.2 ميكرومتر ، مع FOV النشطة CM2 10 ، 18 CM2 ، وMM2 24.4 ، على التوالي. [1-2].
2. مصدر الضوء
خلافا لمعظم الدول الأخرى طرائق التصوير المجهري ، لوكاس لا يحتاج ليزر ، وبالتالي حتى ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي البسيط (LED) يمكن استخدامها للإنارة. من أجل تمكين الانضباطي إنارة الطول الموجي ، ويمكننا الاستفادة أيضا مستوحد اللون مع مصباح زينون (حجر الزاوية T260 ، نيوبورت كورب) جنبا إلى جنب مع الألياف الصف السيليكا تنصهر القياسية التي تتكون من مجموعة من الألياف (77564 ، نيوبورت) والثقب من ~ قطرها 100 ميكرون يقع في ~ 50-10 سم فوق سطح جهاز الاستشعار. هذا الطول الموجي الإضاءة الانضباطي التكوين توفر منصة مرنة حيث يمكن ضبط التواقيع الثلاثية الأبعاد للخلايا ، ويمكن تجميع التواقيع الرقمية المختلطة لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء عن أفضل دقة التوصيف والتحديد. [3]
تحضير العينة باء والتصوير
سيظهر والذي يدل على مفهوم لوكاس استنادا رقاقة التصوير باستخدام حلا غير متجانسة كما هو موضح أدناه. ويمكن تطبيق بروتوكول مماثل لمختلف أنواع الخلايا الأخرى [1-3].
1. كله تخفيف الدم وتحضير المحلول المتجانس
- لبدء هذه العملية ، والحصول على عينة من الدم الكامل وmicrobeads البوليسترين من أقطار مختلفة (5 ، 10 ، و 20 ميكرومتر. ديوك العلمية) ، وجمع كل منهم على درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2 مل من 1640 RPMI السائل وسائل الإعلام الكلاسيكية (فيشر العلمية) بوصفها عقيمة مخفف الى 5 مل أنبوب البولي بروبلين.
- بعد احتضان عينة دم كامل لمدة 30 دقيقة ، بزيادة 10 ماصة ميكرولتر من العينات الرسوبية كرات الدم الحمراء وتحويلها الى حل RPMI.
- إضافة وحدة تخزين ما مجموعه 20 ميكرولتر microbeads البوليسترين في التخفيف RPMI كرات الدم الحمراء ، وتستنهض الهمم الحل الخلية pipetting بلطف أو باستخدام مغناطيسي مع التحريك.
- وضع الحجم الإجمالي ل15/05 حل غير المتجانسة ميكرولتر على غطاء الانزلاق والمركز الثاني ، زلة تغطية مماثلة على حل باستخدام ملقط. وينبغي أن تقع بين العينة زلات تغطي فترتي بالتساوي.
- ثم ، وذلك باستخدام قلم فراغ (NT57 - 636 ، ادموند البصريات) تحميل العينة على المنطقة النشطة من جانب مجموعة أجهزة الاستشعار للتصوير.
2. كامل الدم يلطخ
- بدءا من إعداد مخزنة من مزيج من 0.1 ٪ يوزين Y والمخففة الحل الميثيلين جديد باستخدام القوة نوع نقي يوزين Y (MW = 691.85 ، Acros العضوية) ، والزنك النقي الخالي جديد الميثيلين الأزرق صباغة (MW = 347.90 ، Acros العضوية) ، والبوتاسيوم مونوهيدراتي الأكسالات (ACS الكاشف 99.0 ٪ ، العضوية Acros) ؛ تتم تنقيته من كل حل مع حجم المسام 0.45 ميكرون تصفية Syringless (Whatman) لتلوين مائي الدم البيضاء الخلية.
- ثم ، حرك بلطف حل كاشف تلوين مائي مع عينة دم كامل في نسبة حجم 01:01 في كوب البولي بروبيلين باستخدام مغناطيسي لمدة 2 دقيقة ، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
- نقل حل ملطخة بالدم من 50 ميكرولتر في أنبوب بولي بروبيلين 5 مل وتمييع الحل مع RPMI 1640 السائل الكلاسيكية (فيشر العلمية) من 1.95 مل للاستحواذ على نسبة حجم 1:200. ثم ، دوامة التخفيف لمدة 30 ثانية. ويمكن أيضا أن يكون معدل التخفيف المختلفة التي تم تقديمها في هذه المرحلة.
- ماصة حل الخلية الملطخة 1-10 ميكرولتر بين زلات تغطية أو داخل خزان ميكروفلويديك. ثم ، وذلك باستخدام قلم فراغ (NT57 - 636 ، ادموند البصريات) ، ومكان العينة على المنطقة النشطة من جانب مجموعة أجهزة الاستشعار.
الممثل النتائج
ve_content ">
الشكل 1 : لوكاس تمكن العد دقيقة وتمايز الخلايا الرقمية المختلفة والكائنات الدقيقة على أساس توقيعاتهم الثلاثية الأبعاد 2D دون استخدام أي عدسات الليزر أو غيرها من المكونات البصرية الضخمة. وتتجلى خصائص التوقيعات لوكاس من الكائنات الدقيقة المختلفة في هذا الرقم وبالمقارنة ضد صورة مجهر التقليدية التي تم الحصول عليها مع عدسة الهدف 40X. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
الشكل 2 : (اليسار) صورة أولية من خليط غير متجانس تحتوي خلايا الدم الحمراء ، 10um ، 5um و 3 جزيئات أم. ويوضح (يمين) توصيف لوكاس مؤتمتة بالكامل النتائج لحقل نفس الرأي. علما بأن القرار هو خوارزمية قوية في المناطق التي تتميز بكثافة عالية ، وكذلك جزيئات مع الإشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء مثل الخرز 3um.
الشكل 3 : وتتجلى واجهة مخصصة لوكاس. برنامج جافا لوكاس أساس المدخلات يسمح للظروف تجريبية مختلفة مثل استشعار حجم بكسل أو الطول الموجي للضوء. ويمكن أيضا اختيار مجال محدد من عرض الصور على بذل ويمكن تعريف أنماط الخلية المستهدفة من قبل المستخدم لبناء الخلية الظل الإحصائية المكتبة. ويمكن بعد ذلك صورة لوكاس المكتسبة أن تتسم هذه البيانات على أساس التدريب (أي مكتبة الظل الخلية) ، ويتم عرض علامة (المحسوبة) صورة للمستخدم. يتم أيضا تخزين إحصاءات نتائج العد كملف XML لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد بينت لنا أن النظام الأساسي لوكاس يمكن الاعتماد بشكل دقيق وتحديد مختلف micro-objects/cells على شريحة واستنادا توقيعاتهم الثلاثية الأبعاد ، ويوفر أداة واعدة لنقطة من الرعاية الطبية والتشخيص عالية الإنتاجية بيولوجيا الخلية. نفذنا من أجل العملية بدقة أنماط تسجيل الثلاثية الأبعاد ، وهو قرار مخصص لوكاس نموا البرمجيات. هذه الخوارزمية ، والذي يستخدم قاعدة البيانات الإحصائية حيود صورة إنشاؤها بواسطة التدريب من الصور لوكاس ، ويحدد ملامح مختلفة من الخلايا ضمن حل غير المتجانسة ، يصنف نوع والموقف النسبي للخلايا فردية ، وتعتمد على نوع من الخلايا المطلوبة بعد تطبيق thresholding لتجاهل الجسيمات غير المرغوب فيها / أنماط الخلية [1-3].
باختصار ، ينبغي للمنصة لوكاس توفر حلا فعالا من حيث التكلفة ومدمجا لنقطة من الرعاية الخلوي والتشخيص الطبي. لهذه الغاية ، سوف يكون لوكاس خصوصا مفيدة لرصد مرضى فيروس نقص المناعة البشرية في بيئات محدودة الموارد فضلا عن غيرها من المشاكل الصحية العالمية ذات الصلة مثل الملاريا والسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
