Summary
Lensfree On-Chip-Bildgebung und Charakterisierung von Zellen dargestellt. Diese On-Chip-Cell-Imaging-Ansatz bietet eine kompakte und kostengünstige Tool für die medizinische Diagnostik und High-Throughput-Zellbiologie-Anwendungen, so dass es besonders geeignet für arm an Ressourcen-Einstellungen.
Abstract
Herkömmliche optische Mikroskope Bildzellen durch die Verwendung von Objektiven, die zusammen mit anderen Objektiven und optischen Komponenten. Während sehr effektiv, hat diese klassische Vorgehensweise bestimmte Einschränkungen für die Miniaturisierung der Imaging-Plattform kompatibel zu machen mit den fortgeschrittenen Stand der Technik in der Mikrofluidik. In diesem Bericht stellen wir experimentelle Details eines ohne Linsen auskommt, On-Chip-Imaging-Konzept bezeichnet LUCAS (
Protocol
Hier diskutieren wir die experimentellen Verfahren, die in LUCAS [1-3] beteiligt sind. Zur Veranschaulichung der Proof of Concept von LUCAS beschreiben wir die bildgebenden Verfahren für eine ganze Blutprobe.
A. Imaging Set-up
Die LUCAS Imaging-Plattform weist signifikante Vorteile auf eine kostengünstige und kompakte Alternative zu den bestehenden Point-of-care-Zytometrie und medizinische Diagnose-Tools bieten, vor allem für mit beschränkten Ressourcen. Anstatt erkennen das Bild der Zellen, LUCAS statt erfasst digitale Hologramme der Zellen, die durch die Interferenz des gestreuten Lichtes von jeder Zelle mit dem Hintergrund Licht erzeugt werden. Sorgfältige Kontrolle der partiellen räumlichen Kohärenz der Beleuchtung ist entscheidend für die holographische Aufzeichnung zu ermöglichen.
1. Digitale Sensor-Array
Die LUCAS-Plattform nutzt einen optoelektronischen Sensor-Array digital aufzuzeichnen einzelne Zelle Hologramme. Zu diesem Zweck berechnet paar Geräte (CCD; Beispiel Models: KAI-11002, KAF-39000, von Kodak) oder komplementäre Metall-Oxid-Halbleiter-Chips (CMOS, Sample Model: MT9P031, Micron) verwendet werden kann. Pixel Größen für die Kodak berechnet paar Geräte, KAI-11002, KAF-39000 und Micron CMOS Bildsensoren sind 9 um, 6,8 um und 2,2 um, mit einer aktiven FOV von 10 cm2, 18 cm2, und 24,4 mm2 bzw.. [1-2].
2. Light Source
Anders als die meisten anderen mikroskopischen bildgebenden Verfahren nicht LUCAS nicht braucht einen Laser und damit auch eine einfache Leuchtdiode (LED) können für die Beleuchtung verwendet werden. Um abstimmbare Wellenlänge Beleuchtung ermöglichen, können wir auch nutzen, einen Monochromator mit einer Xenon-Lampe (Cornerstone T260, Newport Corp) zusammen mit einem Standard-Fused Silica-Faser, die aus einem Bündel von Fasern (77564, Newport) und Lochkamera der aus ~ 100 pm Durchmesser bei ~ 5-10 cm über der Sensoroberfläche befinden. Das abstimmbare Wellenlänge Beleuchtung Konfiguration bietet eine flexible Plattform, wo die holographische Unterschriften der Zellen angepasst werden können, und hybride digitale Signaturen können synthetisiert werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern für eine bessere Charakterisierung Genauigkeit und Spezifität werden. [3]
B. Probenvorbereitung und Imaging
Ein Proof of Concept von LUCAS On-Chip-Bildgebung demonstriert mit einer heterogenen Lösung wie unten beschrieben werden. Ein ähnliches Protokoll könnte für verschiedene andere Zelltypen [1-3] angewendet werden.
1. Vollblut Verdünnung und Aufbereitung der heterogenen Lösung
- Zu Beginn des Prozesses, erhalten eine Vollblutprobe und Polystyrol Mikroperlen mit verschiedenen Durchmessern (5, 10 und 20 um. Duke Scientific), und bringen sie alle auf Raumtemperatur.
- Geben Sie 2 ml RPMI 1640 classic flüssigen Medien (Fisher Scientific) als Verdünnungsmittel in eine sterile 5 ml Polypropylen-Röhrchen.
- Nach Inkubation der Vollblutprobe für 30 Minuten, Pipette bis 10 l sedimentierten Erythrozyten Probe und wird in das RPMI-Lösung.
- Fügen Sie ein Gesamtvolumen von 20 ul Polystyrol Mikroperlen in Erythrozyten RPMI verdünnt, und bewegen Sie die Zell-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren oder durch Magnetrührer mit einem Rührstab.
- Legen Sie ein Gesamtvolumen von 5-15 ul heterogene Lösung auf ein Deckglas und legen Sie eine zweite, identische Deckglas über die Lösung mit Hilfe einer Pinzette. Die Probe sollte zwischen den beiden Deckgläschen gleichmäßig angeordnet sein.
- Dann, mit einem Vakuum-Pen (NT57-636, Edmund Optics) laden Sie die Probe auf den aktiven Bereich des Sensor-Arrays für die Bildgebung.
2. Vollblut-Färbung
- Beginnend mit der Herstellung eines Gemisches von 0,1% gepuffert Eosin Y und verwässert New Methylenblau-Lösung mit Power-Typ reine Eosin Y (MW = 691,85, Acros Organics), Zink-free pure New Methylenblau-Farbstoff (MW = 347,90, Acros Organics), und Kaliumoxalat-Monohydrat (99,0% Reagent ACS, Acros Organics); jede Lösung ist mit einem 0,45 um Porengröße Syringless Filter (Whatman) für wässrige weißen Blutkörperchen Färbung gereinigt.
- Dann vorsichtig umrühren gelöster wässriger Färbereagenz mit der Vollblutprobe in einem Volumenverhältnis von 1:1 in einem Polypropylen-Becher mit einem Magnetrührer für 2 Minuten und 10 Minuten inkubieren.
- Übertragen einer gefärbten Blut Lösung von 50 ul in eine 5 ml Polypropylen-Röhrchen und verdünnt mit RPMI 1640 classic flüssigen Lösung (Fisher Scientific) von 1,95 ml bis zu einem Volumen-Verhältnis von 1:200 zu erwerben. Dann Wirbel der Verdünnung für 30 Sekunden. Eine andere Verdünnung können auch in dieser Phase eingeführt werden.
- Pipettiere gefärbte Zelle Lösung von 10-100 ul zwischen Deckgläschen oder innerhalb eines mikrofluidischen Reservoir. Dann, mit einem Vakuum-Pen (NT57-636, Edmund Optics), legen Sie die Probe auf den aktiven Bereich des Sensor-Array.
Repräsentative Ergebnisse
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Abbildung 1: LUCAS ermöglicht eine genaue Zählung und digitale Differenzierung der verschiedenen Zellen und Mikro-Objekte auf ihre 2D-Hologramm-Signaturen ohne Verwendung von Kontaktlinsen, Laser oder andere sperrige optische Komponenten. Charakteristisch LUCAS Unterschriften von verschiedenen Mikro-Objekte sind in dieser Abbildung dargestellt und werden gegen einen herkömmlichen Mikroskop-Bild mit einer 40X Objektiv verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
Abbildung 2: (links) Raw Bild einer heterogenen Mischung, die roten Blutkörperchen, 10um, 5um und 3 um Partikel. (Rechts) Vollautomatische LUCAS Charakterisierung Ergebnisse für das gleiche Sichtfeld dargestellt. Beachten Sie, dass die Entscheidungs-Algorithmus robust bei der Charakterisierung von Regionen hoher Dichte sowie Partikel mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis wie die 3um Perlen ist.
Abbildung 3: Die LUCAS benutzerdefinierte Schnittstelle dargestellt. Java-basierte Software ermöglicht LUCAS-Eingänge für verschiedene experimentelle Bedingungen wie der Sensor Pixelgröße oder die Wellenlänge des Lichts. Die Auswahl eines spezifischen Gebiet der Blick auf das Bild kann auch gemacht werden und die Zielzelle Muster kann vom Benutzer definiert werden, um eine statistische Zelle Schatten Bibliothek zu bauen. Die erworbenen LUCAS Bild kann dann auf Basis dieses Trainings-Daten (dh, die Zelle Schatten Bibliothek) und die markierte (gezählt) Bild wird dem Benutzer angezeigt charakterisiert werden. Statistik des Grafen Ergebnisse werden auch als XML-Datei zur weiteren Analyse gespeichert.
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Discussion
Wir haben gezeigt, dass die LUCAS-Plattform kann genau zu zählen und zu identifizieren verschiedenen micro-objects/cells auf einem Chip auf ihre holographischen Signaturen basieren, und bietet ein vielversprechendes Werkzeug für Point-of-care Diagnostik und High-Throughput-Zell-Biologie. Zur genauen Prozess der aufgezeichneten holographischen Mustern, haben wir ein individuell entwickelte LUCAS Entscheidungs-Software. Dieser Algorithmus, der eine statistische Beugungsbild Datenbank durch die Ausbildung von LUCAS Bilder erstellt nutzt, zeigt verschiedene Eigenschaften von Zellen innerhalb einer heterogenen Lösung; stuft die Art und die relative Position der einzelnen Zellen und zählt die gewünschten Zelltyp nach dem Auftragen Schwellenwert, um unerwünschte Partikel verwerfen / Zelle Muster [1-3].
Zusammenfassend sollte die LUCAS-Plattform bieten eine kostengünstige und kompakte Lösung für Point-of-care-Zytometrie und der medizinischen Diagnostik. Aus diesem Zweck wird LUCAS vor allem für die Überwachung von HIV-Patienten nützlich beschränkten Ressourcen-Einstellungen als auch für andere globale gesundheitliche Probleme wie Malaria und Tuberkulose.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
