Summary
Lensfree片上的成像和细胞的特性说明。这片上的细胞成像方法用于医疗诊断和高通量细胞生物学的应用提供了一个紧凑和成本效益的工具，使得它特别适合资源贫乏地区。
Abstract
工作与其他镜头和光学组件的物镜使用常规的光学显微镜图像细胞。这种传统的方法虽然很有效，有一定的局限性，成像平台，使之与先进国家的最先进的微流体兼容的小型化。在这份报告中，我们引入一个无透镜片上的成像的概念称为卢卡斯的实验细节（
Protocol
在这里，我们讨论的是在卢卡斯[1-3]的实验程序。为了说明卢卡斯的概念证明，我们将描述为一个整体的血液样本的成像过程。
答：成像设置
卢卡斯成像平台表现出显着的优势，对现有的护理点流式细胞仪和医疗诊断工具，尤其是对资源有限的环境，提供成本效益和紧凑的替代。检测细胞的形象，而不是卢卡斯，而不是捕捉的是从每个单元格的背景光的散射光的干扰创建细胞的数字全息图。仔细控制部分空间相干性的照明是至关重要的，使全息记录。
1。数字传感器阵列
卢卡斯平台采用光电传感器阵列，以数字方式记录单个细胞的全息图。为此，收取夫妇器件（CCD;示例模型：KAI - 11002，从柯达KAF - 39000，）或互补金属氧化物半导体芯片（CMOS，样品型号：MT9P031，美光科技公司），都可以使用。像素大小的柯达控告夫妇设备，开，KAF - 39000 11002，微米CMOS图像传感器的9微米，6.8微米和2.2微米，与一个积极的视场为10平方厘米，18平方厘米，24.4 mm2的分别。 [1-2]。
2。光源
不像大多数其他的显微成像方式，卢卡斯不需要激光，因此即使一个简单的发光二极管（LED）可用于照明。为了使可调谐波长照明，我们也可以利用与标准级熔融石英纤维组成的纤维束（77564，新港）和针孔与氙气灯（T260基石，新港公司）的单色~~位于〜5-10厘米以上的传感器表面的直径为100微米。这种可调谐波长照明配置提供了一个灵活的平台，可以调节细胞的全息签名，并可以合成混合数字签名，以改善信噪比更好的表征的准确性和特异性。 [3]
B.样品制备和成像
将演示一个基于片内图像卢卡斯的概念证明，使用一个异构的解决方案，如下所述。类似的协议，可应用于各种其他类型的细胞[1-3]。
1。全血稀释的异构解决方案的准备
- 要开始的过程，获得一个整体的血液样本和各种直径（5，10和20微米。杜克科学）的聚苯乙烯微球，并把他们全部室温。
- 添加到稀释液5毫升无菌聚丙烯管2毫升的RPMI 1640液体培养基（Fisher Scientific则）。
- 全血样品孵育30分钟后，移液器10μL沉淀红细胞标本，并转移到RPMI解决方案。
- 添加到红细胞的RPMI稀释一个总体积20μL的聚苯乙烯微球，并轻轻吹打，或用搅拌棒使用磁力搅拌器搅拌单元解决方案。
- 放置到一个涵盖5-15μL的异构解决方案的总体积滑和地点，在解决方案的第二个相同的覆盖使用镊子滑移。试样应夹在两者之间的盖玻片均匀。
- 然后，使用真空笔（NT57 - 636，埃德蒙光学）加载到的图像传感器阵列的活跃地区的样本。
2。全血染色
- 0.1％的混合物准备开始缓冲曙红Y和稀释后的新亚甲基解决方案，通过使用功率型纯曙红Y（MW = 691.85，Acros Organics公司），纯锌的新亚甲基蓝染料（MW = 347.90，Acros Organics公司）草酸钾一水（99.0％试剂ACS，Acros Organics公司）;每一个解决方案是0.45微米孔径Syringless过滤器（滤纸）水的白血细胞染色与纯化。
- 然后，轻轻搅动一个溶于水染色试剂全血标本在聚丙烯烧杯1:1的体积比使用磁力搅拌2分钟，孵育10分钟。
- 5 mL聚丙烯管转移到一个沾满血的解决方案和50μL的RPMI 1640溶液1.95毫升（尔科技）稀释收购体积比为1:200。然后，涡稀释为30秒。也可以在此阶段引入一个不同的稀释率。
- 移液器染色细胞的10-100μL盖玻片之间，或在一个微水库解决方案。然后，使用真空笔（NT57 - 636，埃德蒙光学），地方上的传感器阵列的活跃地区的标本。
代表性的成果
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图1：卢卡斯可以准确计数和各种细胞和微型物体的二维全息签名，而无需使用任何镜头，激光或其他笨重的光学元件为基础的数字分化。在这个数字说明特色卢卡斯各种微型对象的签名和对传统的显微镜与40X物镜获得的图像进行比较。请点击这里看到图1的放大版本。
图2：（左）原始图像的异构混合物含有红细胞，10um的，5um的和3微米的颗粒。 （右）全自动卢卡斯相同的视野表征结果说明。注意决策算法是强大的高密度地区以及颗粒低信号特征信噪比3um珠等。
图3：卢卡斯自定义接口的说明。基于Java的卢卡斯软件允许，如传感器像素大小或光的波长不同实验条件下的输入。也可以选择一个图像的特定领域和靶细胞的模式可以由用户定义，建立一个统计细胞阴影库。收购了卢卡斯的形象，然后可以基于这种训练数据（即细胞阴影库）和标记（计）图像显示给用户的特点。计数结果的统计数据也将存储作为一个XML文件，作进一步的分析。
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Discussion
我们已经说明，卢卡斯平台可以准确计数和基于全息签名的芯片识别各种micro-objects/cells，点的医疗诊断和高通量细胞生物学提供了一种有前途的工具。为了准确地处理所记录的全息图案，我们实现了一个自定义开发卢卡斯决定的软件。这种算法，它采用了统计培训卢卡斯图像所造成的衍射图像数据库，确定细胞内的异构解决方案的各种功能，单个细胞的类型和相对位置进行分类和应用阈值后，放弃不必要的粒子计数所需的细胞类型/细胞模式[1-3]。
综上所述，卢卡斯平台应该提供一个点保健仪和医疗诊断的成本效益和紧凑的解决方案。为此，卢卡斯，尤其是对艾滋病患者的监测非常有用，在资源有限的设置以及其他全球性健康有关的问题，如疟疾和肺结核。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
