Summary
세포의 Lensfree 온 - 칩 이미징 및 특성은 그림이다. 이 온칩 세포 이미징 접근 방식은 자원 가난한 설정을 위해 특히 적합, 의료 진단 및 높은 처리량 세포 생물학 애플 리케이션을위한 소형 및 비용 효율적인 도구를 제공합니다.
Abstract
다른 렌즈와 광학 구성 요소가 함께 작동 객관적인 렌즈의 사용에 의해 종래의 광학 현미경 이미지 세포. 꽤 효과가 있지만,이 고전적인 방법은 microfluidics에있는 예술의 고급 상태와 호환되도록 이미징 플랫폼의 소형화에 대한 특정 제한 사항이 있습니다. 이 보고서에서는, 우리는 루카스를 칭했다 lensless 온 칩 이미지 개념 실험 세부 사항 (을 소개합니다
Protocol
여기 루카스 [1-3]에 관련된 실험 절차를 논의합니다. 루카스의 개념의 증거를 보여주면 우리는 전체 혈액 샘플에 대한 이미징 프로세스를 설명합니다.
A. 이미징 설정
루카스 이미징 플랫폼은 특히 자원 제한 설정에 대한 기존의 포인트 - 오브 - 케어 cytometry 의료 진단 도구에 대한 비용 효율적인 소형 대안을 제공하는 중요한 이점을 전시하고 있습니다. 오히려 세포의 이미지를 감지하는 것보다 루카스 대신 배경 조명 각 세포에서 흩어져있는 빛의 간섭에 의해 만들어진 세포의 디지털 홀로그램을 캡처합니다. 조명의 부분 공간 일관성에주의 제어 홀로그램 기록을 사용하는 것이 중요합니다.
1. 디지털 센서 어레이
루카스 플랫폼은 디지털 개인 휴대 홀로그램을 기록하는 광전자 센서 배열을 사용합니다. 사용할 수 있습니다 또는 보완 금속 - 산화물 - 반도체 칩 (MT9P031, 마이크론 CMOS, 샘플 모델),이를 위해 몇 가지 장치 (카이 - 11002, KAF - 39000, 코닥의 샘플 모델 CCD) 부과. 각각 활성 10cm2의 FOV, 18cm2, 그리고 24.4 mm2와 코닥을위한 픽셀 크기는 두 장치, 카이 - 11002, KAF - 39000을 충전하고, 마이크론 CMOS 이미지 센서는 9 μm의, 6.8 μm의 및 2.2 μm의 수 있습니다. [1-2].
2. 라이트 소스
대부분의 다른 미세한 이미징 modalities과는 달리, 루카스는 따라서 레이저, 심지어 간단한 발광 다이오드 (LED) 조명에 사용할 수있는 필요하지 않습니다. 조정할 수있는 파장의 조명을 사용하기 위해, 우리는 섬유의 다발 (77564, 뉴 포트)과 핀홀 구성된 표준 등급 융합 실리카 섬유와 함께 제논 램프 (코너 T260, 뉴 포트 주식 회사)로 단색을 활용할 수 있습니다 ~ 100 μm의 직경은 센서 표면 위 ~ 50-10센티미터에 위치하고 있습니다. 이 조정할 수있는 파장 조명 구성 세포의 홀로그램 서명 조정할 수있는 유연한 플랫폼을 제공하고, 하이브리드 디지털 서명은 더 나은 특성화 정확성과 특이성에 대한 잡음 비율로 신호를 향상시키기 위해 합성 수 있습니다. [3]
B. 샘플 준비 및 이미징
영상 - 칩을 기반으로 루카스의 개념 증명은 아래 설명된대로 이기종 솔루션을 사용하여 시연합니다. 유사한 프로토콜은 다양한 세포 유형 [1-3]에 적용할 수 있습니다.
1. 전체 혈액 희석과 이기종 솔루션의 준비
- 프로세스를 시작하려면, 전체 혈액 샘플과 다양한 직경 (5, 10, 20 μm의. 듀크 과학)의 폴리스티렌 microbeads를 얻을하고, 실온에 모두 가져.
- 멸균 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 희석제로서 RPMI 1640 고전 액체 미디어 (피셔 과학) 2 ML을 추가합니다.
- 30 분 전체 혈액 샘플을 잠복기 후, sedimented 적혈구 시료 10 μL를 피펫 및 RPMI 솔루션으로 그것을 전송합니다.
- 적혈구 RPMI 희석에 20 μL 폴리스티렌 microbeads의 총 볼륨을 추가하고 부드럽게 pipetting 또는 저어 막대와 자기 활동가를 사용하여 셀 솔루션을 선동하다.
- 포셉를 사용하여 솔루션을 통해 두 번째 동일한 커버 슬립을 풀 장소 표지에 5-15 μL 이기종 솔루션의 총 볼륨을 넣으십시오. 예제는 균일 두 커버 전표 사이에 끼워 넣으면됩니다.
- 그런 다음, 진공 펜 (NT57 - 636, 에드먼드 광학)를 사용하면 이미지에 대한 센서 배열의 활성 영역에 샘플을로드합니다.
2. 전체 혈액 스테 이닝
- 0.1 %의 혼합물의 준비를 시작으로 전력이 유형의 순수 Eosin Y (MW = 691.85, Acros의 생명체), 아연없는 순수한 새로운 메틸렌 블루 염색 (MW = 347.90, Acros의 유기물을)를 사용하여 Eosin Y와 희석 새로운 메틸렌 솔루션 버퍼 그리고 칼륨 Oxalate 일수화물 (99.0 %의 시약 ACS, Acros의 생명체)가 있으며, 각 솔루션은 0.45 μm의 기공 크기 Syringless 필터 (왓먼) 수성 백혈구의 얼룩을 위해 함께 정화됩니다.
- 그런 다음, 부드럽게 2 분 동안 자기 활동가를 사용하여 폴리 프로필렌의 비커에 1시 1분의 음량 비율에서 전체 혈액 표본과 함께 해산 수성 얼룩 시약을 흔들어 10 분 알을 품다.
- 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 50 μL의 스테인드 혈액 솔루션을 전송하고 1:200의 볼륨 비율을 확보하기 위해 1.95 ML의 RPMI 1640 고전 액체 용액 (피셔 과학)로 희석. 그런 다음, 와동 30 초 희석. 다른 희석 비율도이 단계에서 도입하실 수 있습니다.
- 커버 전표 사이 또는 microfluidic 저수지 내에서 10-100 μL의 스테인드 세포 솔루션을 피펫. 그런 다음, 진공 펜 (NT57 - 636, 에드먼드 광학)를 사용하여, 센서 배열의 활성 영역에 표본을 넣으십시오.
대표 결과
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그림 1 : 루카스가 정확하게 계산하고 렌즈, 레이저 또는 기타 대형 광학 구성 요소를 사용하지 않고 2D 홀로그램 서명을 기반으로 다양한 세포 및 미세 물체의 디지털 차별화 수 있습니다. 다양한 마이크로 개체의 특성 루카스 서명이 그림 그림하고 40X 객관적인 렌즈로 얻은 기존의 현미경 이미지를 비교하고 있습니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 : 적혈구, 10um, 5um, 3 음 입자를 포함하는 이기종 혼합 (왼쪽) RAW 이미지. 보기의 동일한 필드 (오른쪽) 완전 자동 루카스 특성화 결과는 그림입니다. 결정 알고리즘은 3um 비즈 같은 노이즈 비율 고밀도 지역뿐만 아니라 낮은 신호 입자를 특성화로 강력한입니다.
그림 3 : 루카스 사용자 인터페이스가 그림입니다. 자바 기반의 루카스 소프트웨어는 센서 픽셀 크기 또는 빛의 파장 등 다양한 실험 조건에 대한 입력을 허용합니다. 이미지를보기의 특정 분야의 선택도 만들 수 있으며, 대상 세포 패턴은 통계 셀 그림자 라이브러리를 빌드하기 위해 사용자가 정의할 수 있습니다. 인수 루카스 이미지는 다음이 훈련 데이터 (즉, 세포 그림자 라이브러리)와 표시 (계산) 이미지가 사용자에게 표시됩니다에 따라 특징 수 있습니다. 카운트 결과의 통계도 추가 분석을위한 XML 파일로 저장됩니다.
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Discussion
우리는 루카스 플랫폼이 정확하게 계산하고 홀로그램 서명을 기반으로 한 칩에 다양한 micro-objects/cells을 식별할 수있는 그림, 그리고 포인트의 케어 의료 진단 및 높은 처리량 세포 생물학을위한 유망한 도구를 제공합니다. 정확하게 기록된 홀로그램 패턴을 처리하기 위해, 우리는 사용자 지정 개발 루카스 결정 소프트웨어를 구현했습니다. 루카스 이미지의 훈련에 의해 만들어진 통계 회절 이미지 데이터베이스를 사용하는이 알고리즘은, 이기종 솔루션 내에서 세포의 다양한 기능을 식별하고, 종류와 각각의 세포의 상대적 위치를 분류하고 원하지 않는 입자를 폐기하기 위해 thresholding를 적용한 후에 원하는 세포 유형을 계산 / 셀 패턴 [1-3].
요약에서, 루카스 플랫폼 포인트 - 오브 - 케어 cytometry 및 의료 진단을위한 비용 효율적이고 컴팩트한 솔루션을 제공해야합니다. 이를 들어, 루카스는 특히 자원 제한 설정에서뿐만 아니라 말라리아와 결핵과 같은 다른 세계 보건 관련 문제에 대한 HIV 환자의 모니터링에 유용합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
