Summary
Lensfree imagens on-chip e caracterização de células é ilustrada. Esta abordagem on-chip imagens de células fornece uma ferramenta compacta e cost-effective para diagnósticos médicos e de alto rendimento aplicações de biologia celular, tornando-o especialmente adequado para locais de poucos recursos.
Abstract
Óptico convencional microscópios células de imagem pelo uso de lentes objetivas que trabalham em conjunto com outras lentes e componentes ópticos. Embora bastante eficaz, esta abordagem clássica tem algumas limitações para a miniaturização da plataforma de imagem para torná-lo compatível com o estado avançado da arte em microfluídica. Neste relatório, nós apresentamos detalhes experimental de um conceito de imagem sem lente no chip denominado LUCAS (
Protocol
Aqui vamos discutir os procedimentos experimentais que estão envolvidos no LUCAS [1-3]. Para ilustrar a prova de conceito de LUCAS vamos descrever o processo de imagem para uma amostra de sangue total.
A. Imagem Set-up
O LUCAS plataforma de imagem exibe vantagens significativas para fornecer uma alternativa econômica e compacta para existentes citometria de ponto de atendimento médico e ferramentas de diagnóstico, especialmente para ambientes com recursos limitados. Em vez de detectar a imagem das células, em vez LUCAS captura hologramas digitais das células que são criadas pela interferência da luz espalhada a partir de cada célula com a luz de fundo. Controle cuidadoso da coerência parcial espacial dos iluminação é fundamental para permitir a gravação holográfica.
1. Array de Sensor Digital
A plataforma LUCAS utiliza um conjunto de sensores optoeletrônicos para gravar digitalmente hologramas célula individual. Para este fim, cobrado dispositivos casal (CCD; Modelos Amostra: KAI-11002, KAF-39000, da Kodak) ou complementary metal-oxide semiconductor-chips (CMOS, Modelo Amostra: MT9P031, Micron) pode ser usado. Tamanhos de pixel para a Kodak cobrado dispositivos casal, KAI-11002, KAF-39000, e os sensores de imagem CMOS Micron são 9 mM, 6,8 mM e 2,2 mM, com um FOV ativa de 10 cm2, 18 cm2, mm2 e 24,4, respectivamente. [1-2].
2. Fonte de Luz
Ao contrário da maioria das outras modalidades de imagem microscópica, LUCAS não requer um laser e, portanto, até mesmo um simples diodo emissor de luz (LED) pode ser usado para a iluminação. A fim de permitir a iluminação de comprimento de onda sintonizáveis, também podemos utilizar um monocromador com uma lâmpada Xenon (Cornerstone T260, Newport Corp), juntamente com um padrão de fibra de sílica fundida grade que consiste de um feixe de fibras (77564, Newport) e pinhole de ~ 100 mM de diâmetro localizado na ~ 5-10 cm acima da superfície do sensor. Esta configuração de iluminação ajustável de comprimento de onda fornece uma plataforma flexível onde as assinaturas holográfica das células pode ser ajustada, e híbridos assinaturas digitais podem ser sintetizados para melhorar a relação sinal-ruído para melhor caracterização precisão e especificidade. [3]
B. Preparação da Amostra e Imagem
A prova de conceito de LUCAS baseada no chip de imagem será demonstrado através de uma solução heterogênea, conforme descrito abaixo. Um protocolo semelhante poderia ser aplicada para vários outros tipos de células [1-3].
1. Diluição de sangue total e preparação da solução heterogênea
- Para iniciar o processo, obter uma amostra de sangue total e microesferas de poliestireno de vários diâmetros (5, 10 e 20 mM. Duke Científica), e trazer todos eles para a temperatura ambiente.
- Adicionar 2 mL de RPMI 1640 classic meios líquidos (Fisher Scientific) como diluente em um tubo de polipropileno estéril 5 mL.
- Após incubar a amostra de sangue total por 30 minutos, pipetar até 10 L de amostra de eritrócitos sedimentados e transferi-lo para a solução de RPMI.
- Adicionar um volume total de 20 microesferas de poliestireno mL em RPMI diluição dos eritrócitos, e agitar a solução da célula com cuidado pipetando ou usando agitador magnético com uma barra de agitação.
- Coloque um volume total de 5-15 mL de solução heterogênea em uma tampa de deslizamento e colocar um segundo, lamínula idênticos sobre a solução usando uma pinça. A amostra deve ser imprensada entre as duas lamínulas uniformemente.
- Em seguida, usando uma caneta de vácuo (NT57-636, Edmund Optics) de carga da amostra para a região ativa do conjunto de sensores de imagem.
2. Manchas de sangue total
- Começando com a preparação de uma mistura de 0,1% tamponado Eosina Y e Solução de metileno diluído New usando o poder tipo puro Eosina Y (MW = 691,85 Organics, Acros), zinco-free pura New corante azul de metileno (MW = 347,90 Organics, Acros), Monohydrate e oxalato de potássio (ACS Reagente 99,0%, Acros Organics), cada solução é purificado com um tamanho de 0,45 mM poros do filtro Syringless (Whatman) para a coloração de células brancas do sangue aquoso.
- Então, mexa delicadamente um reagente coloração dissolvido aquosa com a amostra de sangue total em uma relação de volume de 1:1 em um copo de polipropileno, utilizando um agitador magnético por 2 minutos e incubar por 10 minutos.
- Transferência de uma solução manchadas de sangue de 50 mL em um tubo de polipropileno 5 mL e diluir com solução de RPMI 1640 classic líquido (Fisher Scientific) de 1,95 mL para adquirir uma relação de volume de 1:200. Em seguida, vortex, a diluição por 30 segundos. A taxa de diluição diferentes também podem ser introduzidos nesta fase.
- Pipetar uma solução célula corada de 10-100 mL entre lamínulas ou dentro de um reservatório microfluídicos. Em seguida, usando uma caneta de vácuo (NT57-636, Edmund Optics), coloque o espécime para a região ativa da matriz de sensor.
RESULTADOS REPRESENTANTE
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Figura 1: LUCAS permite a contagem exata ea diferenciação digital de várias células e micro-objetos com base em suas assinaturas 2D holográfico sem o uso de lentes, lasers ou outros componentes ópticos volumosos. Assinaturas características LUCAS de vários micro-objetos são ilustrados nesta figura e são comparados com uma imagem de microscópio convencional obtida com uma lente objetiva de 40X. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2: (Esquerda) imagem Raw de uma mistura heterogênea contendo células vermelhas do sangue, 10um, 5um e 3 partículas um. (Direito) totalmente automatizado resultados da caracterização LUCAS para o mesmo campo de visão são ilustradas. Note que o algoritmo de decisão é robusto para caracterizar regiões de alta densidade, bem como partículas com baixo sinal-ruído, tais como as contas 3um.
Figura 3: O LUCAS interface personalizada é ilustrado. Baseados em Java software LUCAS permite entradas para várias condições experimentais, tais como o tamanho do pixel do sensor ou o comprimento de onda da luz. Seleção de um campo específico de vista sobre a imagem também pode ser feita e os padrões de célula-alvo pode ser definido pelo usuário para construir uma biblioteca sombra estatística celular. A imagem adquirida LUCAS pode então ser caracterizado com base em dados de treinamento (ou seja, a biblioteca sombra de células) e da imagem marcada (contados) é exibida para o usuário. Estatísticas dos resultados contam também são armazenados como um arquivo XML para análise posterior.
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Discussion
Temos ilustrado que a plataforma LUCAS pode contar com precisão e identificar micro-objects/cells vários em um chip com base em suas assinaturas holográfico, e fornece uma ferramenta promissora para o ponto de atendimento diagnósticos médicos e de alto rendimento biologia celular. Com precisão, a fim de processar os padrões registrados holográfico, implementamos um software customizado decisão LUCAS. Este algoritmo, que utiliza um banco de dados de difração de imagem estatística criado por formação de imagens LUCAS, identifica várias características de células dentro de uma solução heterogênea; classifica o tipo ea posição relativa de células individuais e conta o tipo de célula desejada após a aplicação de thresholding para descartar partículas indesejadas / padrões célula [1-3].
Em resumo, a plataforma de LUCAS deve fornecer uma solução de custo eficaz e compacto para ponto-de-cuidado e citometria de diagnósticos médicos. Para este fim, LUCAS será especialmente útil para o monitoramento de pacientes HIV em ambientes de recursos limitados, assim como para outros problemas de saúde globais relacionados, tais como a malária ea tuberculose.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
