Summary
Lensfree на-чипе изображения и характеристики клеток показано на рисунке. Это на-чипе ячейки визуализации подход обеспечивает компактный и экономически эффективного инструмента для медицинской диагностики и высокой пропускной способности приложений клеточной биологии, что делает его особенно подходящим для ограниченных ресурсов.
Abstract
Обычные оптические микроскопы изображение клетки путем использования объективов, которые работают вместе с другими линз и оптических компонентов. Хотя довольно эффективным, этот классический подход имеет определенные ограничения для миниатюризации изображений платформу для приведения его в соответствие с передовыми состояние искусства в микрофлюидики. В данном отчете мы представляем экспериментальные детали безлинзовой на-чипе визуализации концепции называют LUCAS (
Protocol
Здесь мы обсуждаем экспериментальных процедур, которые участвуют в LUCAS [1-3]. Для иллюстрации доказательство концепции LUCAS мы опишем процесс визуализации для всего образца крови.
А. изображений Настройка
Платформа LUCAS изображений экспонатов существенные преимущества для обеспечения экономически эффективной и компактной альтернативой существующим пункт-уход цитометрии и медицинских диагностических инструментов, особенно с ограниченными ресурсами. Вместо того, обнаружение образ клетки, LUCAS, а не перехватывает цифровой голограммы клетки, которые создаются помехи рассеянного света от каждой ячейки с фонового света. Тщательный контроль частичной пространственной когерентности освещения важно включить голографической записи.
1. Цифровой массив датчиков
Платформа LUCAS использует массив оптико-электронных датчиков для цифровой записи голограмм отдельные клетки. Для этой цели взимается пару устройств (CCD; Пример модели: KAI-11002, KAF-39000, от Kodak) или комплементарных металло-оксидных-полупроводниковых чипов (CMOS, проба Модель: MT9P031, Micron) могут быть использованы. Pixel размеров для Kodak взимается пару устройств, KAI-11002, KAF-39000, и Micron КМОП-датчиков изображения 9 мкм, 6,8 мкм и 2,2 мкм, при активном поле зрения 10 см2, 18 см2, и 24,4 мм2 соответственно. [1-2].
2. Источник света
В отличие от большинства других микроскопических форм визуализации, Лукас не требует лазера и поэтому даже простой светодиод (LED) могут быть использованы для освещения. Для того чтобы включить освещение перестраиваемых длин волн, мы можем также использовать монохроматор с ксеноновой лампы (Cornerstone T260, Newport Corporation) вместе с эталонной смеси плавленого кварцевого волокна, состоящий из пучка волокон (77564, Ньюпорт) и накола ~ 100 мкм в диаметре расположены на ~ 5-10 см выше поверхности датчика. Это перестраиваемых конфигурации освещения длиной волны предоставляет гибкую платформу, где голографическое подписей клетки могут быть скорректированы, и гибридные цифровые подписи могут быть синтезированы для улучшения отношения сигнал-шум для большей точности характеристик и специфики. [3]
Б. Подготовка проб и обработка изображений
Доказательство концепции LUCAS основана на чипе изображения будут продемонстрированы с использованием гетерогенных раствора, как описано ниже. Аналогичный протокол может применяться для различных других типов клеток [1-3].
1. Всего разбавления крови и подготовка гетерогенных решений
- Чтобы начать процесс, получить весь образец крови и полистирола микрошарики различных диаметров (5, 10 и 20 мкм. Герцог Scientific), и довести их всех до комнатной температуры.
- Добавить 2 мл RPMI 1640 классических СМИ жидкости (Fisher Scientific) в качестве растворителя в стерильный 5 труба полипропиленовая мл.
- После инкубации весь образец крови в течение 30 минут, пипетки на 10 мкл осевших эритроцитов образца и передать его в раствор RPMI.
- Добавить общим объемом 20 мкл микрошарики полистирола в эритроцитах разбавления RPMI, и агитировать клетка решение, осторожно пипеткой или с помощью магнитной мешалки с мешалкой.
- Место общим объемом 5-15 мкл гетерогенный раствор на покровное стекло и место второй, идентичный скольжения накрытия над решение с помощью щипцов. Образец должен быть зажат между двумя крышка скользит равномерно.
- Затем, используя вакуум перо (NT57-636, Эдмунд оптики) нагрузка на образец активной области сенсоров для работы с изображениями.
2. Всего Окрашивание крови
- Начиная с подготовки смеси 0,1% буферный Eosin Y и разводненная новое решение метилен с помощью степенной чистой Eosin Y (MW = 691,85, Acros Organics), без содержания цинка, чистая Новая метиленового синего красителя (MW = 347,90, Acros Organics), и калия оксалат моногидрат (99,0% реагента ACS, Acros Organics); каждое решение очищается с 0,45 мкм размер пор Syringless фильтр (ватман) для водных белого окрашивания клеток крови.
- Затем, осторожно перемешать растворенного водного реагента окрашивания цельной крови в объемном соотношении 1:1 в полипропиленовых стакан с помощью магнитной мешалки в течение 2 минут и выдержать в течение 10 минут.
- Передача окрашенных решение крови 50 мкл в 5 мл полипропиленовые трубы и разбавить RPMI 1640 классический жидкий раствор (Fisher Scientific) в 1,95 мл приобрести объемном соотношении 1:200. Затем вихрь разведения в течение 30 секунд. Разной скоростью разбавления могут быть также введены на данном этапе.
- Внесите окрашенных решение ячейки 10-100 мкл между крышкой скользит или в течение микрожидкостных водохранилище. Затем, используя вакуум перо (NT57-636, Эдмунд оптики), место образца на активной области сенсоров.
ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ
ve_content ">
Рисунок 1: LUCAS позволяет точный подсчет и цифровых дифференциацию различных клеток и микро-объектов на основе их 2D голографических подписей без использования линз, лазеров или других громоздких оптических компонентов. Характеристика подписей LUCAS различных микрообъектов показаны на этом рисунке и сравниваются с обычными изображений, полученных с микроскопа 40х объектив. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2: (слева) Сырье образ гетерогенной смеси, содержащей красных кровяных клеток, 10um, 5um и 3 мкм частиц. (Право) Полностью автоматизированная LUCAS характеристика результатов для той же поле зрения проиллюстрированы. Обратите внимание, что решение алгоритма является надежной при характеристике высокогорных районах плотность, а также частицы с низким отношением сигнал-шум, таких как 3УМ бисером.
Рисунок 3: Интерфейс LUCAS обычай показано на рисунке. Java основан LUCAS программное обеспечение позволяет входы для различных экспериментальных условий, таких как датчик размера пиксела или длины волны света. Выбор конкретного поля зрения на изображении могут быть сделаны и модели клетки-мишени могут быть определены пользователем для создания статистической библиотеки тень клетки. Приобрел LUCAS образ может быть охарактеризована на основе этой подготовки данных (например, библиотеки ячейки тени) и помеченные (счет) изображение отображается для пользователя. Статистика результаты подсчета также хранятся в виде XML-файл для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали, что платформа LUCAS может точно определить количество и различные micro-objects/cells на чипе на основе их голографические подписей, а также предоставляет перспективным инструментом для точки-санитарной помощи медицинской диагностики и высокой пропускной способностью клеточной биологии. Для того, чтобы точно процесса записаны голографические узоры, мы внедрили специально разработанные LUCAS решение программного обеспечения. Этот алгоритм, который использует статистическую базу данных дифракционного изображения созданные подготовки изображений LUCAS, определяет различные функции клеток в гетерогенные решения; классифицирует тип и взаимное расположение отдельных клеток и рассчитывает желаемый тип клеток после применения порога отбрасывать нежелательных частиц / элемент модели [1-3].
Таким образом, платформа LUCAS должны обеспечить экономически эффективной и компактное решение для точки-санитарной помощи цитометрии и медицинской диагностики. Для этой цели LUCAS будет особенно полезна для наблюдения за больными ВИЧ в условиях ограниченных ресурсов, а также другие глобальные проблемы со здоровьем, таких как малярия и туберкулез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
