Summary
Hücre Lensfree çip üzerinde görüntüleme ve karakterizasyonu gösterilmiştir. Bu çip üzerinde hücre görüntüleme yaklaşımı, kaynak yoksul ayarları için özellikle uygun hale, tıbbi teşhis ve yüksek verimli hücre biyolojisi uygulamaları için kompakt ve maliyet-etkin bir araç sağlar.
Abstract
Diğer lens ve optik bileşenlerin birlikte çalışan nesnel lenslerin kullanımı ile Konvansiyonel optik mikroskoplar görüntü hücreleri. Oldukça etkili olmakla birlikte, bu klasik yaklaşım Mikroakiskan sanat gelişmiş devlet ile uyumlu hale getirmek için görüntüleme platformu minyatürleştirme için bazı sınırlamalar vardır. Bu raporda, LUCAS olarak adlandırılan, bir lensless çip üzerinde görüntüleme kavramının deneysel detaylar (tanıtmak
Protocol
Burada LUCAS [1-3] dahil olan deneysel prosedürleri tartışacağız. LUCAS kavramı kanıtı göstermek için biz bütün bir kan örneği görüntüleme işlemi anlatacağım.
A. Görüntüleme Set-up
LUCAS Görüntüleme platformu, özellikle kaynak sınırlı ayarları için bir maliyet-etkin ve kompakt bir alternatif, mevcut bakım noktası sitometri ve tıbbi tanı araçları sağlamak için önemli avantajlar sergiliyor. LUCAS hücrelerin görüntü tespit yerine, her bir hücrenin arka plan ışığı ile dağınık ışık girişim tarafından oluşturulan hücrelerin yerine dijital hologramlar yakalar. Aydınlatma kısmi mekansal tutarlılığı dikkatli kontrol holografik kayıt etkinleştirmek için kritik öneme sahiptir.
1. Dijital sensör dizisi
LUCAS platformu optoelektronik sensör, dijital olarak tek tek hücre hologramlar kaydetmek için bir dizi kullanır. Kullanılabilir: veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken çip (MT9P031, Micron CMOS, Örnek Model): Bu amaçla, çift cihazlar (KAI-11002, Kodak KAF-39000, Örnek Modeller CCD) ücret. Sırasıyla, aktif bir 10 cm2 FOV, 18 cm2, ve 24.4 mm2 Kodak piksel boyutlarında çift cihazları, KAI-11002, KAF-39000 ücret ve Micron CMOS görüntü sensörleri, 9 mm, 6.8 mm ve 2.2 mm. [1-2].
2. Işık kaynağı
Diğer çoğu mikroskopik görüntüleme yöntemlerinin aksine, LUCAS, bu nedenle bir lazer ve hatta basit bir ışık yayan diyot (LED) aydınlatma için kullanılan gerektirmez. Dalga boyu ayarlanabilir aydınlatma sağlamak için, biz de liflerin paket (77.564, Newport) ve iğne deliği oluşan standart bir not erimiş silika elyaf ile birlikte bir Xenon Lamba (Cornerstone T260, Newport Corp) ile monokromatör yararlanabilirler ~~ 100 mikron çapında ~ sensör yüzeyi üzerinde 5-10 cm bulunmaktadır. Bu ayarlanabilir dalga boyu aydınlatma yapılandırma hücrelerin holografik imzaları ayarlanabilir esnek bir platform sağlar ve melez dijital imzalar sinyal gürültü oranı daha iyi karakterizasyonu doğruluk ve özgüllük için geliştirmek için sentezlenmiş olabilir. [3]
B. Numune Hazırlama ve Görüntüleme
Aşağıda açıklandığı gibi heterojen bir çözüm kullanarak görüntüleme-çip tabanlı LUCAS kavramı bir kanıtı sunulacaktır. Benzer bir protokol, çeşitli hücre tipleri [1-3] için uygulanabilir.
1. Tam kan sulandırma ve heterojen bir çözümün hazırlanması
- Sürecine başlamak için, bütün bir kan örneği ve çeşitli çaplarda (5, 10 ve 20 mikron. Duke Bilimsel) polistiren mikro almak ve hepsi oda sıcaklığına getirmek.
- RPMI 1640 classic sıvı ortam (Fisher Scientific) bir seyreltici olarak steril bir 5 ml polipropilen tüpe 2 mL ekleyin.
- 30 dakika boyunca tam kan inkübe sonra, 10 mcL tortulaşmış eritrosit örnek pipet ve RPMI çözüm içine aktarın.
- 20 mcL polistiren mikro toplam hacmi, eritrosit RPMI seyreltme içine ekleyin ve hafifçe pipetleme veya bir heyecan çubuğu ile manyetik karıştırıcı kullanılarak hücre çözümü kışkırtmak.
- 5-15 mcL heterojen bir çözüm toplam hacmi, forseps kullanarak ikinci bir çözüm üzerinde, aynı kapak kayma kayma ve yerde bir kapak üzerine yerleştirin. Örnek eşit iki kapak fişleri arasında sıkışmış olmalı.
- Sonra, bir vakum kalem (NT57-636, Edmund Optik) kullanarak görüntüleme sensörü dizinin aktif bölge üzerine örnek yüklemek.
2. Tam Kan Boyama
- % 0.1 'lik bir karışım hazırlanması ile başlayan güç tipi, saf Eosin Y (MW = 691,85, Acros Organics), çinko içermeyen saf Yeni Metilen Mavi boya (MW = 347,90, Acros Organics) kullanarak Eosin Y ve seyreltilmiş Yeni Metilen Çözüm tamponlu Potasyum Oksalat Monohidrat (99.0% Reaktif ACS, Acros Organik); her çözüm 0,45 mikron gözenek boyutu Syringless Filtresi (Whatman) sulu beyaz kan hücre boyama ile arındırılır.
- Sonra, yavaşça, 2 dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı kullanılarak bir hacim oranı 1:1 bir polipropilen beher tam kan örneği ile çözünmüş sulu boyama reaktif karıştırın ve 10 dakika inkübe edin.
- 5 ml polipropilen tüpe 50 mcL lekeli bir kan çözüm aktarın ve 1:200 bir hacim oranı elde etmek için RPMI 1640 classic 1.95 ml sıvı solüsyon (Fisher Scientific) ile seyreltilir. Daha sonra, 30 saniye için seyreltme girdap. Farklı bir seyreltme oranı da bu aşamada devreye alınabilir.
- Kapak fişleri arasında veya bir mikroakışkan rezervuar içinde 10-100 mcL lekeli bir hücre çözümü Pipet. Sonra, bir vakum kalem kullanarak (NT57-636, Edmund Optik) numune, sensör dizisi aktif bölge üzerine yerleştirin.
TEMSİLCİSİ SONUÇLAR
ve_content ">
Şekil 1: LUCAS doğru sayma ve çeşitli hücreler ve mikro-nesneleri lensler, lazerler veya diğer hantal optik bileşenleri kullanarak 2 boyutlu holografik imzalar dayalı dijital farklılaşma sağlar. Karakteristik LUCAS imzaları çeşitli mikro-nesneleri bu resimde gösterildiği ve 40X objektif lens ile elde edilen geleneksel bir mikroskop görüntü karşılaştırılır. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2: (Sol) Ham görüntü, kırmızı kan hücreleri, 10um, 5um ve 3 um parçacıklar içeren heterojen bir karışım . Aynı alan için (Sağ) Tam otomatik LUCAS karakterizasyonu sonuçları gösterilmiştir. Karar algoritması 3um boncuklar gibi gürültü oranı yüksek yoğunluklu bölgelerinde, düşük sinyal ile parçacıkların yanı sıra karakterize sağlam olduğunu unutmayın.
Şekil 3: LUCAS özel arayüz gösterilmiştir. Java tabanlı LUCAS yazılımı gibi sensör piksel boyutu veya ışık dalga boyu gibi çeşitli deneysel koşullar için girdi sağlar. Resmin üzerine görüş belirli bir alan seçimi de yapılabilir ve hedef hücre modelleri, istatistiksel bir hücre gölge kütüphane oluşturmak için kullanıcı tarafından tanımlanabilir. , Elde edilen LUCAS görüntü, daha sonra bu eğitim verileri (örneğin, hücre gölge kütüphane) ve işaretlenmiş (sayılır) resim kullanıcıya görüntülenen dayalı karakterize edilebilir. Sayımı sonuçları, istatistikler, aynı zamanda daha fazla analiz için bir XML dosyası olarak depolanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LUCAS platformu doğru saymak ve holografik imzaları dayalı bir çip üzerinde çeşitli micro-objects/cells tespit gösterildiği gibi, noktası bakım, tıbbi teşhis ve yüksek verimli hücre biyolojisi için umut vaat eden bir araç sağlar. Doğru kaydedilen holografik desen işlemek için geliştirilmiş özel bir LUCAS karar yazılım uygulanmaktadır. LUCAS görüntülerin eğitim tarafından oluşturulan bir istatistik kırınım görüntü veritabanını kullanır Bu algoritma, heterojen bir çözüm içindeki hücrelerin çeşitli özelliklerini belirler; türü ve tek tek hücrelerin göreli konumunu sınıflandırır ve istenmeyen parçacık atmak için eşikleme uyguladıktan sonra istenilen hücre tipi sayar / hücre desenleri [1-3].
Özetle, LUCAS platformu noktası bakım sitometri ve tıbbi teşhis için bir maliyet-etkin ve kompakt bir çözüm sunmalıdır. LUCAS, bu amaç için, özellikle kaynak sınırlı ayarları gibi sıtma ve tüberküloz gibi diğer küresel sağlık ile ilgili sorunların yanı sıra HIV hastaların izlenmesi için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAI-11002 | |
| Charged couple device (CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9P031 | |
| Xenon Lamp | Newport Corp. | Cornerstone T260 | |
| Vacuum pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 5, 10, and 20 μm Microbeads | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4000 Series | |
| RPMI | Fisher Scientific | 1640 | |
| Pure Eosin Y | Acros Organics | MW=691.85 | |
| New Methylene Blue(NMB) Dye | Acros Organics | MW=347.90 | |
| Potassium Oxalate Monohydrate | Acros Organics | 99.0% Reagent ACS |
References
- Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. "Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics". Lab Chip. , (2009).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" . Biotechnology and Bioengineering. , (2008).
- Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. "Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction". Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).
