Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires
Summary
Cette vidéo montre une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Dissocié neurones commissuraux sont utiles pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance de l'axone et d'orientation.
Abstract
Neurones commissuraux ont été largement utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents guidage axonal pendant le développement embryonnaire, la moelle épinière. Les corps cellulaires de ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et leurs axones suivent des trajectoires stéréotypées pendant le développement embryonnaire. Axones commissuraux initialement projet ventralement vers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones tourner vers l'avant et le projet vers le cerveau. Chacune de ces étapes est réglementée par l'action de plusieurs signaux de guidage. Cultures hautement enrichi dans les neurones commissuraux sont idéalement adaptés à de nombreuses expériences aborder les mécanismes de pathfinding axone, y compris les essais de tournage, l'immunochimie et la biochimie. Ici, nous décrivons une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Tout d'abord, la moelle épinière est isolé et bandes dorsales sont disséquées. Le tissu dorsale est alors dissocié en une suspension de cellules par trypsinisation et les perturbations mécaniques. Les neurones sont étalées sur des lamelles en verre poly-L-lysine ou de culture de tissus plats. Après 30 heures<em> In vitro</em>, La plupart des neurones ont prolongé d'un axone. La pureté de la culture (Yam<em> Et al.</em> 2009), généralement plus de 90%, peut être évaluée par immunomarquage avec le neurone marqueurs CDC, commissurale LH2 et TAG1 (Helms et Johnson, 1998). Cette préparation neuronale est un outil utile pour<em> In vitro</em> Les études des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des axones commissuraux et des conseils lors du développement de la moelle épinière.
Protocol
Discussion
Nous avons décrit une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats embryonnaires. Cette procédure a été couramment utilisée dans notre laboratoire pour préparer les neurones de manière fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du guidage axonal. Pour la biologie cellulaire et des expériences d'immunochimie, la dissection d'une litière suffisante produit des neurones. Lorsque plusieurs cellules sont nécessaires, comme dans de n…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), le chercheur Peter Lougheed Medical Research Foundation, le Programme de McGill en neuroingénierie, le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI ). Sébastien D. Langlois a été soutenue par de bourse de formation à la maîtrise de la Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) et par une Frederick Banting et Charles Prix du Meilleur études supérieures du Canada Bourses de maîtrise des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Nous sommes reconnaissants à Jessica Pham MT à l'aide de chiffres.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
| B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
| L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
| Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
| DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
| MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
| HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
| L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
- E13 pregnancy-staged rat
- Ethanol 70%
- Surgical scissors, Fine Science Tools
- Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
- Petri dishes
- L-15 medium
- Dissection microscope, Leica
- Plastic transfer pipettes
- Microscissors, Fine Science Tools
- Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
- Heat-inactivated Horse Serum (HiHS)
- 15 ml plastic tubes
Commissural neuron culture (see also Table I)
- Tissue culture incubators (37°C, 5% CO2, humidity controlled)
- German Desag glass coverslips and/or plastic tissue culture dishes
- Poly-L-lysine, Sigma
- Sterile milliQ H2O
- Neurobasal, Invitrogen
- Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HiFBS)
- L-Glutamine
- B27, Invitrogen
- Penicillin/Streptomycin antibiotics
- 37°C waterbath
- Sterile Pasteur Pipettes
- Bunsen gas burner
- HBSS, Ca2+/Mg2+-free, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO4
- Centrifuge
- Hemacytometer
- Trypan Blue Solution
References
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc. Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).
- Helms, A. W., Johnson, J. E. Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression. Development. 125, 919-928 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons. Nature. 444, 369-373 (2006).
- Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway. Neuron. 62, 349-362 (2009).
