이 동영상은 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 보여줍니다. Dissociated commissural 뉴런이 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다.
Abstract
Commissural 뉴런 널리 배아 척수 개발 중에 축삭의 가이드를 기본 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 뉴런의 세포 기관은 등의 척수에 위치하고 axons은 배아 발달 동안 틀에 박힌 궤도를 따라하고 있습니다. Commissural axons 처음 floorplate 향해 ventrally 프로젝트. 정중선을 건너 후 다음 axons은 두뇌 향해 anteriorly 및 프로젝트 설정합니다. 이러한 각 단계는 여러지도 단서의 조치에 의해 규제됩니다. 높은 commissural 뉴런의 풍부한 문화가 이상적으로 돌리는 assays, immunochemistry 및 생화학을 포함하여 축삭의 pathfinding의 메커니즘을 주소 다양한 실험에 적합합니다. 여기, 우리는 E13 쥐 등의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 첫째, 척수는 격리되고 지느러미 스트립이 밖으로 해부하고 있습니다. 등의 조직 trypsinization 및 기계적 방해하여 세포 현탁액에 다음 dissociated 있습니다. 뉴런은 폴리 – L – 라이신 – 코팅 유리 coverslips 또는 조직 문화 요리에 도금입니다. 30시간 후<em> 체외에서</em> 대부분의 뉴런은 축삭을 확대했습니다. 문화의 순도 (얨<em> 외.</em> 2009), 일반적으로 90% 이상 commissural 신경 세포의 마커의 DCC, LH2 및 TAG1 (헬름스 앤드 존슨, 1998)과 immunolabeling에 의해 평가하실 수 있습니다. 이것의 연결 준비에 유용한 도구입니다<em> 체외에서</em> 척수 개발 중에 commissural 축삭의 성장과지도의 세포 및 분자 메커니즘 연구.
Protocol
1. 배아 쥐 등의 척수의 해부 일반 권장 사항 얼음 L – 15 중간을 유지하고 자주 배아는 냉각 유지하는 해부 접시에있는 매체를 변경합니다. 이것은 조직 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 명시되지 않는 한 모든 단계 더몬트 # 5 포셉 두 쌍이있는 수행됩니다. 오염을 피하기 위해, 70 % 에탄올 모든 도구와 작업 표면을 스프레이하고 해부 매체 병 감아. 요리 …
Discussion
우리는 배아 쥐의 척수에서 뉴런을 해부하다 commissural과 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이 절차는 정기적으로 안정적으로 축삭지도의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 뉴런을 준비하기 위해 우리가 실험실에서 사용되고 있습니다. 세포 생물학 및 immunochemistry 실험 한 쓰레기의 해부에 충분한 신경을 생산하고 있습니다. 더 많은 세포가 필요로하는 경우 등 많은 생화학 실험, 두 새끼의 절개처…
Acknowledgements
이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 피터 로히드 의학 연구 재단, Neuroengineering에있는 맥길 프로그램에서 교부금에 의해 지원되었다, 퐁 드 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ), 그리고 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI ). 쎄바스띠앙 D. 랑그르와는 퐁에서 석사 훈련 수상에 의해 지원되었다 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)과 프레드릭 밴팅와 찰스 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에서 최고의 캐나다 대학원 장학금 석사 수상. 우리는 숫자와 함께 도움 제시카 MT 팸에 감사하고 있습니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Neurobasal medium, liquid
Invitrogen
21103-049
See Recipes and Comments
B27 supplement 50X
Invitrogen
17504
See Recipes and Comments
Poly-L-lysine 0.01% solution
Sigma
P4707
L-15 medium, powder
Invitrogen
41300-070
Trypsin 2.5% (10X)
Invitrogen
15090-046
DNAse I, 25000 U/mL
Worthington
MgSO4
Sigma
M2643
HBSS, Ca2+/Mg2+-free
Invitrogen
14170-112
L-glutamine 200mM, liquid
Invitrogen
25030-081
See Recipes and Comments
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
E13 pregnancy-staged rat
Ethanol 70%
Surgical scissors, Fine Science Tools
Forceps, Dumont #5, Fine Science Tools
Petri dishes
L-15 medium
Dissection microscope, Leica
Plastic transfer pipettes
Microscissors, Fine Science Tools
Tungsten needles and pin holders (one hook-shaped needle, one L-shapes needle, one straight needle), Fine Science Tools
Langlois, S. D., Morin, S., Yam, P. T., Charron, F. Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (39), e1773, doi:10.3791/1773 (2010).