Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.
Kommissuralen Neuronen wurden häufig verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der embryonalen Entwicklung des Rückenmarks zu untersuchen. Die Zellkörper dieser Neurone sind in der dorsalen Rückenmark und ihre Axone folgen stereotype Trajektorien während der embryonalen Entwicklung. Kommissuralen Axone zunächst ventral Projekt auf die Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, diese Axone anterior und Projekt in Richtung des Gehirns. Jeder dieser Schritte wird durch die Wirkung von mehreren Führung Cues geregelt. Kulturen stark in kommissuralen Neuronen angereichert sind ideal für viele Experimente Bewältigung der Mechanismen der Axon Wegfindung, einschließlich Drehen Assays, Immunchemie und Biochemie geeignet. Hier beschreiben wir eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Zuerst wird das Rückenmark isoliert und dorsalen Streifen sind herauspräpariert. Die dorsale Gewebe wird dann in eine Zellsuspension durch Trypsinierung und mechanische Störungen dissoziiert. Neuronen sind auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläschen oder Gewebe-Kulturschalen plattiert. Nach 30 Stunden<em> In-vitro-</em> Haben die meisten Neuronen ein Axon verlängert. Die Reinheit der Kultur (Yam<em> Et al.</em> 2009), in der Regel über 90%, kann durch Immunomarkierung mit dem kommissuralen Neuron Marker DCC, LH2 und TAG1 (Helms und Johnson, 1998) beurteilt werden. Diese neuronale Vorbereitung ist ein nützliches Werkzeug für<em> In-vitro-</em> Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen der kommissuralen Axon Wachstum und Führung während des Rückenmarks Entwicklung.
Wir haben eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus embryonalen Ratte Rückenmark beschrieben. Dieses Verfahren wurde routinemäßig in unserem Labor verwendet werden, um zuverlässig vorzubereiten Neuronen, die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon Anleitung zu studieren. Für Zellbiologie und Immunchemie Experimenten Dissektion einen Wurf erzeugt genügend Neuronen. Wenn mehr Zellen benötigt werden, können wie in vielen biochemischen Experimenten Dissektion der zwei Würfe erforderlic…
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Peter Lougheed Medical Research Foundation, die McGill-Programm in Neuroengineering unterstützt, dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und der Canada Foundation for Innovation (CFI ). Sébastien D. Langlois wurde von einem Master-Training Award aus dem Fonds unterstützten de la recherche en santé du Québec (FRSQ) und durch einen Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Stipendien Master Award der Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Wir sind dankbar, dass Jessica MT Pham für die Unterstützung bei Zahlen.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
Commissural neuron culture (see also Table I)