Summary
Методика описана для имплантации четыре
Abstract
Запись с ключевыми нервов и мышц
Protocol
1. Электрод Изготовление
- Для создания электродов, используйте ножницы, чтобы вырезать кусок покрытой эмалью 0,001 дюйма диаметр проволоки из нержавеющей стали около 2 метров в длину. Прикрепите шарик замазки, чтобы каждый конец проволоки, согните провод пополам, и спина концов, что позволяет создать витая пара, называется дифференциальный электрод.
- Лента обоих концах провода, чтобы предотвратить разгадке. Сделать четырех дифференциальных электродов, используя разные цвета ленты для каждого дифференциального электрод для целей идентификации (рис. 1А).
- Твист двух дифференциальных электродов вместе, оставляя два дюйма раскрученные на одном конце и 1 дюйм на другом конце. Повторите с оставшейся пары дифференциальных электроды (рис. 1В).
- Твист оба набора из двух электродов дифференциальных вместе, убедившись, что концы остаются раскрученные. Держите до электрода собраний и нанесите клей бытовых силиконовых на стыке четырех электродов дифференциальных, оставляя концы свободными. Повесьте и позволит клею высохнуть в течение не менее 4 часов (рис. 1в).
- Чтобы оградить филиалы, лежал электродный узел вниз на ровную, подвижные, поверхность, например кусок дерева. Веером концы и закрепите их с лентой. Используйте небольшой кусок пластика, чтобы поднять электродного узла непосредственно перед отраслей, а также обеспечить, что с лентой.
- На вскрытии микроскоп, использование щипцов, чтобы покрыть ветви с силиконовым клеем. 1-дюймовые длинные концы будет внутри животного, поэтому они должны иметь очень тонкий слой клея. Разрешить клей сохнуть в течение не менее 3 часов.
- Сократить 1-дюймовый длинный конец одного дифференциального электрода до двух сантиметров. На каждый провод, удалите 1 см силикона и эмали. Curl один голый провод в крюк для записи. Бенд другой провод вверх и в сторону от крючка, это будет служить провод заземления. Повторите эти действия для остальных трех электродов.
- Выберите один из четырех электродов на 2 дюйма конца. Используйте пинцет, чтобы очистить силикон и эмали прочь, подвергая 1 см голой проволоки из нержавеющей стали на каждом из 2 провода. Припой золота разъем для каждой из двух проводов. Используйте кусок ленты лаборатории для обеспечения конца и поддерживать расстояние между землей и записи контактов. Повторите эти действия для остальных трех электродов.
- Прикрепить 1-2см шар силиконовые клея кабеля, около 1,5 см от крючка конец якоря электродов внутри животного. Дайте высохнуть в течение по крайней мере на один час (рис. 1D).
Рисунок 1. Изготовление электродов Ассамблеи. (А), один электрод, состоящий из дифференциальных сложить и витой проволоки с ее концы обеспеченные с лентой. (Б) Два электрода дифференциальных скрученных вместе, оставляя пространство раскрученные на концах. Разноцветные ленты или другого маркировка должна быть использована для идентификации целей. (C) Все четыре электрода дифференциальных объединены в единую сборку электрода, образуя единый кабель с отдельным отраслям отдельных электродов на каждом конце, отмеченные различными цветами ленты. (D) Окончательная форма электрода сборки. На левом, Есть свернувшись крючки для записи и заземляющие провода для каждого дифференциального электрода. Справа, золото контактный разъем были припаяны к проводам для подключения к усилителю. Якорь шар силиконовые клея также был сделан по отношению к левой части сборки.
2. Подготовка животных для имплантации
- Выберите здоровое животное, которое весит около 350-450гр. В ответ на мелкие кусочки водорослей, животное должно генерировать укусов с интервалом от 3 до 5 секунд. Полный хирургии с имплантацией электродов должно занять около часа.
- Для обезболивания животных, внедрить его на 30% вес / объем изотонического MgCl 2. Чтобы предотвратить потерю гемолимфы и MgCl 2, инъекции могут быть покрыты в суперклей, прежде чем снимать иглы.
Рисунок 2. Схема показывает, как животное возлагали на электрод имплантации, и расположение разреза (указано бар). - Положите под наркозом животного в рассечение лоток с его ногой. Облицовка животных в лоб, сдвиг области жаберных слева от вас, что животное частично на боку, опираясь прочь. Придавить переднюю щупальцами (рис. 2).
- Место лоток на этапе вскрытия микроскопом. Подоприте лоток примерно под углом 20 градусов, чтобы поднять голову и собирать гемолимфы в хвосте, подальше от разреза.
- Использование рассечение ножницами, начать разрез чуть справа от глазка и расширить его от 1 до 1,5 см вперед. Используйте преднатяжителями прилагается к краям лотка провести разрез открытой (рис. 2; отметить бар у глазка указывает разрез).
- Чтобы разоблачить щечной массы, использование щипцов, чтобы поднять ясно мембраны подкожи и использовать ножницы, чтобы вырезать открытие соответствующих основных разреза. Tuck краев мембраны в преднатяжителями.
3. Электрод Имплантация
- Место сборки электродов на микроманипулятора и переместить его на разрез животного.
- Радулы нерва является наиболее трудно получить доступ, и следует подходить в первую очередь. Есть два варианта для доступа радулы нерва.
- Первый вариант, который является предпочтительным, это посмотреть в ротовой ганглии между BN1 и BN2. Если ветвь нерва радулы видна, используйте с острым концом щипцов согнута в крюк, чтобы вырвать власть (рис. 3, петли RN под ганглия помечены 1).
- Если ветвь нерва радулы не доступен выше мышцы, второй вариант является для доступа к нему через небольшой разрез в I2 рядом с соединительной ткани у основания ротовой ганглии (рис. 3, Р. под мышцу помечены 2). Разрез в I2 должны пройти через два слоя I2 мышцы. Держитесь за край мышцы разрез с прямыми щипцами и использовать щипцы подключили вытащить отрасль RN.
- Удерживая нерва с подключили щипцы, использовать другой набор щипцов для манипулирования электродом крюк на нерв.
- Использование микроманипулятора поднять крючок так, что нерв поднял от щечной массы и от любых других нервов или тканей. Не перенапряжение нервов.
- Сухой электрода использованием Ким-Wipe или всасывания от лишней жидкости с помощью шприца. Вода может вызвать напряжение нервов, чтобы свернуть на себя, или водяного затвора в форме под нерва. В любом случае, область должна быть полностью высушены перед наносится клей.
- Нанесите небольшое прикосновение суперклей, где базе крюк находится в контакте с нижней части нерва. Применять капли Aplysia физиологическим раствором или гемолимфы установить суперклеем. Когда клей мокрой ничего не должно быть перенесено, как получение клея между проволокой и нервные будет блокировать электрического соединения.
- Сухой крючок еще раз. Смешайте Kwik-Sil клея на лед.
- Используйте кончик булавки нанесите небольшое количество Kwik-Sil клея, полностью покрывая любой оголенный провод от крючка, но не заземления.
- Разрешить клей для установки в течение примерно 5 минут, перестраивать клей, если он начнет удаляться от разделы крючок. Клея устанавливается, когда она уже не палочки при прикосновении с контактный (Рисунок 4 показывает окончательной конфигурации).
- После радулы электрода нерва установлено, I2 мышц может быть доступно. В зоне между BN1 и BN2, используйте щипцы подключили к крючок и отделить 2 полос I2 мышцы от остальных мышц, осторожно потянув полосы вверх. Прикрепите электрод используя ту же процедуру.
- Ротовая нервы 2 и 3 легко доступны и электроды прикрепляют с той же процедурой.
- После того как все электроды крепятся, слайд-электрод сборки в животное до силиконовых якорь.
- Шовный разреза сомкнулись вокруг выступающих кабеля электрода, сохраняя якорь внутри животного. Суперклей стежки, чтобы обеспечить хорошее уплотнение.
- Вставьте золота штекеров для подключения на другой конец электрода в небольшой блок пенополистирола. Вернуться животное танка в газированных контейнер для восстановления изоляции на ночь.
Рисунок 3. Схема установки Aplysia кормления известный как щечной массы. Показаны щечной нервов (BN1, BN2, BN3), радулы нерва (RN), что выходит из нижней части щечной ганглия, а затем погружается под мышцу, и место на I2 мышц, где электрод прилагается.
Рисунок 4. Принципиальная схема одного электрода придается нерва (или мышцы) и клееного на месте. Обратите внимание, что де-изолированные области свернувшись крючок находится в прямом контакте с нерва (или мышцы), закрепить на месте с суперклеем, и электрически изолированы от текучей среды, использованием Kwik-Соль. Отметим также, что deinsulated кончика бокового электрода подвергается воздействию жидкой среде.
4. Запись
- Акклиматизироваться животных в контейнере в то время как газированные прилагается к регистрирующей аппаратуры в течение не менее 1,5 часов. Монитор сигнала при акклиматизации животных, чтобы убедиться, что все электроды работают и, что уровни шума низкий.
- Использование видеокамеры для записи пищевого поведения при использовании компьютера для записи сигналов от нервных и мышечных электродов. Синхронизация видео и записи на основе электрода прямоугольный сигнал, который управляет цифровой счетчик в камеры, когда он одновременно учитываются как дополнительный канал на компьютере в Axoscope.
- Кормление поведения вызван методы де-описаны в Мортон и Chiel 1993 года.
Хотя беспозвоночные животные не требуют официального одобрения со стороны институциональных использование животных и ухода комитета, мы добились того, что все процедуры по Aplysia минимизировать вред и страдания животного, и что все хирургические методы сделаны в то время как животное полностью под наркозом.
Представитель Результаты
Рисунок 5. () Одновременное четыре записи канала из мышц (мышц транспортир I2), а из трех щечной нервов (радулы нерва, RN, щечной нерва 2, BN2 и щечной нерва 3, BN3) во время глотания ответ. (B), стоп-кадр из одновременная запись видео свободно себя животное, как ласточки полосы нарезанные водоросли (0,5 см в ширину), который был отмечен на уровне 0,5 см интервалы с белыми полосами, так что ее движения можно легко представить как кормов для животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевой инновацией, который сделал эти записи успешным является сочетание электродов в одном кабеле. Два электрода записи были использованы раньше, но расширяется до четырех отдельных электродов привело к образованию хирургических спайки, которые часто не животное от создания нормальных движений кормления. Объединение электродов в один кабель меньше масса электродов внутри животного, которое в свою очередь снижает иммунную реакцию и позволяет животному двигаться более свободно.
Других инновационных аспектов этой процедуры является сочетание суперклей и Kwik-Sil приложить электроды к нервным или мышцы. Раньше только суперклей были использованы, но сочетание этих двух клеев работает более надежно и может длиться несколько дней дольше, чем суперклей, который распадается в среднем около 3 дней при контакте с водой.
Мы показали, что можно имплантировать электроды в внеклеточной нетронутыми, поведение животных для записи или возбуждение от клеточных тел лицо из числа указанных нейронов [Warman и Chiel, 1995;. Лу и др., 2008]. Несколько техники электрод, который мы описали в этой статье может быть использовано для одновременной записи с и управлять деятельностью четырех различных определили нейронов, или комбинации нейронов, мышцы и нервы.
Мы используем технику с четырьмя электродами, но вполне вероятно, что он будет работать в течение нескольких дополнительных электродов. Кроме того, в неопубликованном эксперименте, эти электроды были использованы для записи с pudental нерва крысы, указывая, что некоторые аспекты этой методики могут быть полезны в позвоночных животных и у человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы выражаем искреннюю благодарность поддержке NIH (NS047073 к HJC). Мы также благодарны Екатерине Келе для ее ранних экспериментов с Kwik-Sil, которые побудили нас использовать его для нашего приложения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
